口腔微生物组在口腔精准医疗中的运用
徐欣, 何金枝, 周学东
口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心,四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科 成都 610041
[通信作者] 周学东,教授,博士,Email:zhouxd@scu.edu.cn

[作者简介] 徐欣,副教授,博士,Email:xin.xu@scu.edu.cn

·专家简介·

徐欣,副教授,四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科副主任。先后赴美国伊利诺伊大学芝加哥分校牙学院及约翰·霍普金斯大学医学院研修。以口腔感染性疾病病因和防治为主研方向,在口腔微生物群落生理演替及致病分子机制相关基础与应用基础研究方面具有较深造诣。先后主持国家级、省部级科研项目9项,发表中、英文学术论文80余篇,主编/参编中、英文学术专著/教材9部,获授权国家发明专利3项,获省部级及以上科技奖励2项。现任中华口腔医学会生物医学专业委员会委员、四川省口腔医学会牙体牙髓病学专业委员会常务委员、四川省口腔医学会口腔生物学专业委员会委员。

摘要

现代医学已从“以疾病为导向”转至“以患者为导向”,开启了以个体化医疗为目标的精准医疗时代。人体的生理功能不但由自身基因组决定,还受共生菌群即人类微生物组的塑造与影响。目前,人类微生物组的研究已经超越了简单解析组成成员与疾病之间的相关性,开始深入分析其对复杂疾病发病、诊断及治疗的贡献,这些突破性研究成果有望成为推动个性化精准医疗的重要助力。本文着重介绍口腔微生物组的最新研究进展、口腔微生物组在疾病早期风险预警、早期诊断、治疗及疗效评估等方面的探索性运用,讨论了口腔微生物组在精准医疗发展中的潜力,以及整合口腔微生物组信息,实现精准医疗所面临的重大挑战。

关键词: 口腔微生物组; 精准医疗; 组学研究; 精准预警; 精准诊断; 精准治疗; 精准疗效评估
中图分类号:R37    文献标志码:A       doi: 10.7518/gjkq.2017.06.001
Oral microbiome in the precision medicine
Xu Xin, He Jinzhi, Zhou Xuedong.
State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Dept. of Conservative Dentistry and Endodontis, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract

Modern medicine has shifted from “disease oriented” to “patient oriented” and has consequently created a new era of personalized medicine or precision medicine. The physiological functions of the human body are determined not only by the human genome but also by symbiotic microflora. Currently, studies on the human microbiome have extended from a simple analysis of the association of bacteria and diseases to a complex analysis of the role of microbiome in the pathogenesis, diagnosis, and treatment of diseases. These breakthroughs possibly promote the practice of personalized/precision medicine. This review summarizes the advances in oral microbiome-related research. In particular, the potential role of oral microbiome in the risk prediction, diagnosis, treatment evaluation, and prognosis of diseases is extensively discussed. Current challenges in the development of oral microbiome-based precision medicine are also described.

Keyword: oral microbiome; precision medicine; omics; precise risk prediction; precise diagnosis; precise therapy; precise evaluation

在“ 以疾病为导向” 的发展时期, 医学侧重于探索特定疾病的诊断、预防和治疗方法。在该阶段, 虽然导致个体间临床表现和治疗效果差异的因素未知, 实践证明这些诊断、预防和治疗方法在多数患者(非全部)中有效。随着人类对自身生理特点的认识提升至基因水平, 各种高通量组学技术的快速发展、生物信息与大数据共享等交叉运用的兴起, 现代医学开始从“ 以疾病为导向” 向“ 以患者为导向” 转变, 开启了以个体化医疗为目标的个性化医疗(personalized medicine)或精准医疗(precision medicine)时代[1]

通过对大样本人群中特定疾病生物学标记物的分析、鉴定、验证与运用, 精准医疗旨在精确寻找疾病的病因及治疗靶点; 对处于疾病不同状态和阶段的个体进行精准分型; 开发针对个体特定遗传组成、生存环境、生活方式的个性化疗法, 最终实现个体化精准诊断、治疗与预防[2, 3, 4]

迄今为止, 精准医疗的最先进突破均来自于对人体自身基因组的监控。例如, 通过筛选种系编码基因突变, 定制个性化的肿瘤早期预防及治疗措施[2]。值得注意的是, 人体的生理功能不但由自身基因组决定, 而且还受其共生菌群即人类微生物组(human microbiome)的塑造与影响。微生物组赋予了人类不依赖于自身进化的复杂的个体特征, 被称为“ 人体第二基因组” 。Jeffrey Gordon研究团队发现微生物组与肥胖之间的关系, 大量研究[5, 6, 7, 8]也证实人类微生物组生态失调与多种疾病间的关联, 如葡萄糖不耐受、2型糖尿病和胰岛素抵抗、老化相关疾病等。目前, 人类微生物组的研究已经超越了简单解析其成员与疾病间的相关性, 开始深入分析其对复杂疾病发生、发展及治疗预后的影响, 这些突破性研究成果有望成为推动个性化精准医疗的重要助力。

口腔是仅次于肠道的人体第二大微生物存储库, 口腔微生物组是人体微生物组的重要组成。口腔微生物组是定植于人类口腔的微生物及其遗传组织的总和[9, 10]。口腔微生物组相关性疾病影响着全球超过一半的人口, 其医护费用与全球十大常见死亡病因相当, 而且与早产、动脉粥样硬化、肝硬化、糖尿病、阿尔茨海默病、偏头痛等全身性或慢性疾病显著相关[11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]。与人体其他部位的共生微生物群落相比较, 口腔微生物组研究具有取样快捷、宿主反应表征方便、干预手段直接有效等特点。此外, 超过65%的口腔细菌类群已可培养, 诸多代表性菌株的全基因组信息已被破译。这些特点使得口腔微生物组在疾病预警、早期诊断、疗效评估等方面具备作为模式研究体系与技术示范对象的重要优势。

本文介绍多组学时代背景下口腔微生物组的最新研究进展, 口腔微生物组在疾病风险评估、早期诊断、疗效评估等方面的探索性运用; 讨论了口腔微生物组对精准医疗发展的巨大推动力, 以及实现基于口腔微生物组学信息的精准医疗所面临的挑战。

1 多组学综合运用形势下的口腔微生物组学研究新进展

与微生物学的其他亚学科一样, 口腔微生物组学研究近年来在宏基因组、宏转录组、宏蛋白质组、宏代谢组等高通量组学技术的推动下, 实现了多维度、多方向的快速发展。

口腔微生物宏基因组学研究主要包括两个方面:一是揭示微生物群落多样性、种群结构及其变化、微生物间相互关系及微生物与口腔环境间的关系; 二是通过筛查功能基因, 发现微生物群落功能基因及其产物。第一个方向的主要技术手段为16S核糖体RNA(ribosomal RNA, rRNA)编码基因测序和DNA-DNA杂交芯片(如美国福赛斯研究中心开发的人类口腔微生物芯片); 第二个方向的主要技术手段为全基因组鸟枪法测序及功能基因DNA-DNA杂交芯片(如美国俄克拉何马大学开发研制的人类微生物组功能基因芯片)。宏基因组学研究[18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26]发现, 口腔微生物组具有种类复杂、多层次多位点分布、受年龄及牙列更替压力、具有个体间差异性及个体内相对稳定性、与遗传背景相关等特点。在疾病研究方面, 口腔微生物宏基因组学研究的主要成果包括:1)进一步证实了龋病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭、口腔扁平苔藓、口腔癌等口腔常见疾病的多微生物感染性, 发现了一些新的、与这些疾病密切相关的菌种[27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54]; 2)进一步验证了口腔微生物组与心血管疾病、消化系统疾病、肿瘤、早产、糖尿病、类风湿性关节炎、神经系统疾病等众多慢性非传染性疾病之间的关联, 发现了一些与疾病发生、发展潜在相关的菌种[13, 14, 17, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65]; 3)发现口腔微生物组受到人体健康与疾病状态的精细调节, 并可对人体健康与疾病状态迅速产生渐进式、可重复的适应性调整, 放大机体的临床前症状[66, 67]。从严格意义上讲, 口腔微生物组在宏基因组学层面的研究尚不深入, 绝大多数研究停留在基于16S rRNA的微生物组多样性分析, 对微生物群落功能基因研究较少。笔者课题组[30]采用功能基因组芯片从牙周微生物宏基因组中首次垂钓了与牙周炎发病相关的功能基因, 发现牙周炎患者口腔微生物组功能基因较健康人群发生明显改变:毒力因子、糖胺聚糖代谢及嘌呤代谢相关的编码基因在牙周炎患者龈下菌斑中大量富集, 而参与氨基酸合成的相关基因呈现相反趋势。一项以龋病人群为研究目标、采用鸟枪法对宏基因组进行测序的研究[40]表明, 在龋活跃患者的牙菌斑中可检测到产酸相关性基因、DNA摄入及应激态相关基因富集; 更有意义的是, 在釉质龋表面的微生物群落中, 与糖酵解以及酸应激反应相关的基因富集, 而在牙本质龋的微生物群落中糖酵解和酸应激反应的基因丰度较低[68], 提示口腔微生物组在疾病发生过程中的精细变化不仅反映在微生物组成多样性方面, 同时还表现在功能基因结构上。

宏转录组兴起于宏基因组之后, 可从整体上研究某一特定环境、特定时期群体全部基因组转录状况以及转录调控规律。宏转录组学以生态环境中的全部RNA为研究对象, 避开未培养微生物的分离培养难题, 有助于从转录水平研究复杂的微生物群落变化。近年来, 宏转录组开始被运用于牙周炎[69, 70]和龋病[71]的研究。2012年Frias-Lopez和Duran-Pinedo[72]在体外多菌种生物膜模型中探索了牙周致病菌入侵对生物膜宏转录组的影响, 提出宏转录组研究在口腔疾病机制研究中具有重要意义。进一步对比牙周炎患者与健康人群龈下菌斑生物膜的功能性差异, 发现牙周炎患者龈下菌斑中与摄铁、脂多糖合成及鞭毛合成相关的基因转录活跃; 意外的是, 在牙周炎患者中上调的绝大多数毒力因子来自传统意义上的非牙周病原体[69]。在龋病研究方面, 与单糖和双糖代谢相关的功能基因占到了龈上菌斑生物膜宏基因组的15%, 而与双糖代谢相关的转录本比与单糖代谢相关的转录本更为普遍[71]

RNA翻译的过程中存在着复杂的调控机制。虽然宏转录组学研究可揭示群落中不同mRNA的相对量, 但mRNA水平并不与蛋白质表达水平呈线性关系[73]。宏蛋白质组学技术的发展为研究复杂生态系统中蛋白质的鉴定和定量提供了可能。目前, 宏蛋白质组学已被成功运用于口腔疾病的相关研究。通过对健康人群唾液上清液进行分析, 研究者[74]确定了来自124个菌属的肽类物质; 发现唾液中的蛋白质参与了20个KEGG代谢通路。此外, Belda-Ferre等[75]构建了人类牙菌斑生物膜的第一个蛋白质库, 并分析了龋病患者及健康人牙菌斑生物膜蛋白质组的差异, 发现健康个体有较多的L-乳酸脱氢酶和精氨酸酶系统, 参与了pH缓冲; 其他表达水平较高的蛋白质主要包括与胞外多糖的合成、铁代谢及免疫反应等相关的蛋白质。龈沟液是血液在牙周组织的渗出液。牙周炎患者龈沟液中微生物源性蛋白质在宏蛋白质组中的比例显著高于健康人群, 而机体防御相关的蛋白质如防御素及半胱氨酸蛋白酶抑制剂B仅在健康人群中检出[76]。在实验性牙龈炎患者的龈沟液中, 除梭杆菌外膜蛋白外, 其他其细菌源性蛋白质均未出现明显变化[77]

宏代谢组学是效仿基因组学和宏蛋白质组学的研究思想, 对生物体内所有代谢物进行定量分析, 并寻找代谢物与生理、病理变化之间关系的研究方式。由于宏代谢组与生物的表型或生理状态关系最为密切, 因此从理论上讲, 宏代谢组学分析所提供的信息更能够提示基因和表型之间的关系。口腔微生物宏代谢组学研究的主要难点在于临床样本中的微生物源性与宿主源性代谢产物相互混杂, 难以区分。Takahashi等[78]深入分析了龋病初发阶段龈上菌群的代谢物质, 结果发现含漱糖溶液后, 口腔龈上菌群的宏代谢组发生了系列变化, 包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖- 1, 6-二磷酸、丙酮酸、6-磷酸葡萄糖酸盐、核酮糖-5-磷酸、乙酰辅酶A在内的多种与糖代谢相关的中间代谢产物水平显著上升。对牙周炎患者龈下菌群宏代谢组学研究[79]发现, 牙龈炎及牙周炎患者的龈沟液内, 肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟苷、鸟嘌呤与健康人群存在显著差异, 提示与活性氧产生密切相关的嘌呤代谢途径在疾病部位广泛激活; 此外, 牙周病患者的唾液代谢物中, 二肽、氨基酸、碳水化合物、脂质、核酸代谢产物均表现出与健康人群不同的分布趋势。

多组学技术的综合运用快速更新并丰富了现有口腔微生物知识体系。相较于RNA、蛋白质及代谢水平上的研究, 基于16S rRNA的口腔微生物组成及多样性研究在口腔领域更为深入。如前所述, 这些研究不仅发现了生理状态下口腔微生物组的特点及影响因素、病理状态下口腔微生物组的精细改变, 更重要的是, 探讨了口腔微生物组在口腔及全身系统性疾病的风险预测和疗效评估中的作用, 示范了微生物组学研究对精准医疗发展的巨大推动力。

2 口腔微生物组与口腔疾病精准预警

口腔疾病多系慢性疾病, 影响了全球近39亿人, 2010年全球用于牙科疾病治疗的直接费用总计2 980亿美元, 间接费用总计1 440亿美元[80]。因此, 实现口腔疾病的早期预警具有重要的社会意义。目前已有各种临床检查、实验室分析和调查问卷参数被用于口腔疾病的风险评估中。然而, 这些评估多基于主观评判或既往患病经历, 信息收集复杂, 涉及多种临床检查、实验室检查和问卷调查结果, 更重要的是忽略了口腔共生菌群对于维持健康和引发疾病的关键作用而未能得到广泛的临床应用。

从理解口腔微生物组与龋病关系的机制入手, 徐健课题组[27]通过监测50名儿童龋病发生情况、龈上菌斑和唾液菌群改变, 发现菌群的改变先于龋病临床症状出现。通过疾病相关性微生物构建了“ 龋病的菌群指数” (microbial indicator of caries, MiC)用于龋病的临床预警。MiC能够在临床龋病发生之前(即亚健康状态), 以81%的准确率预测儿童早期龋的发病。相较于目前常用的龋病风险评估方法, 如X线检测、特定微生物计数、唾液生物化学指标测定、口腔卫生状况评估、个人社会生活地位调查, MiC不依赖于牙医或患者的主观判断, 也不依赖于细菌培养, 在准确性、客观性、可重复性、可比较性等方面具有优势。除龋病之外, 初步证据[66, 67]表明从健康状态到牙龈炎的发生、发展过程中, 口腔微生物组也存在一个渐进的变化过程, 提示通过监测口腔微生物组改变的关键“ 拐点” , 实现牙龈炎风险预测的可行性。

3 口腔微生物组与口腔疾病精准诊断

目前口腔疾病诊断的常见方法, 如视诊、探诊、叩诊、扪诊、X线片等均从症状出发。从常见口腔疾病的始发因素— — 口腔微生物组出发, 有望为口腔疾病的精准诊疗提供新的思路。

通过监测志愿者在牙龈炎康复、发展和再康复过程中牙菌斑菌群结构和功能的变化, 研究人员[66]发现了与牙龈炎严重程度显著相关的细菌属, 并以此构建了一种基于微生物的新型牙龈炎严重程度诊断方法。该项诊断方法被命名为“ 牙龈炎的菌群指数” (microbial index of gingivitis, MiG), 准确率高达95%。此外, 该项研究还发现人群可根据口腔微生物的组成划分为牙龈炎“ 敏感型” 和“ 耐受型” 两类。以8个细菌属构建的“ 牙龈炎微生物易感指数” (MiG-sensitivity)区分上述两种类型的准确率达到74%, 从而揭示了人群中牙龈炎易感性迥异的一个重要因素。可以预期, 通过MiG与MiG-sensitivity两大指标对就诊人群的牙龈炎严重程度及对疾病的敏感性进行精准分类, 有助于口腔医生根据患者的具体情况制定个性化医疗活动, 实现口腔精准医疗。

口腔微生物组在精准诊断全身系统性疾病方面的潜力也开始凸显。通过比较类风湿性关节炎患者的唾液、菌斑及肠道微生物组的组成, 研究者[62]发现类风湿性关节炎患者上述3个部位的微生物组组成及群落功能与健康人群存在显著差异, 且这些差异与临床指标具有相关性。更为重要的是, 研究者[33]通过8个肠道宏基因关联组(me-tagenomic linkage group, MLG)构建的类风湿性关节炎诊断模型, 具有92%的特异性及83.3%的精准度, 与目前常用的基于血清学的类风湿性关节炎诊断方法效能相当; 通过6个菌斑MLG和2个唾液MLG拟合的诊断模型, 其特异性和精准度也高于80%; 综合肠道、菌斑及唾液MLG信息进行诊断模型构建, 具有更好的精准度及特异性。这一研究不仅证实了口腔微生物组在精准诊断中的巨大潜能, 同时提示多位点微生物组信息整合可有效提高诊断效能。

4 口腔微生物组与口腔疾病精准治疗

口腔细菌性疾病(如龋病、牙周病)与口腔常驻菌群在致病条件下过度生长, 导致口腔微生态失衡进而机会致病密切相关。靶向抑制引起口腔微生态失衡的疾病相关细菌, 是恢复口腔微生态平衡, 实现疾病精准治疗的有效途径。美国加利福尼亚大学洛杉矶分校施文元教授课题组研发了一种名为“ 目标特异性抗菌多肽” (specifically targeted anti-microbial peptide, STAMP)的新型抗生素。每个STAMP由一个非特异性的杀菌模块和一个针对特定菌种的目标结合模块组成。其工作原理是目标结合模块特异性地识别病原菌, 进而通过与其连接的杀菌模块靶向杀灭病原菌。以龋病为例, 研究者根据龋病相关细菌— — 变异链球菌感受态刺激肽(competence stimulating peptide, CSP)的蛋白质序列, 设计了STAMP目标结合模块, 从而将杀菌模块靶向投送到变异链球菌。这种STAMP可从多菌种生物膜中特异性清除变异链球菌, 并不影响种系关系相近却非致龋的其他口腔链球菌生长。因此, STAMP可通过选择性杀灭致龋相关的变异链球菌, 逆转因变异链球菌过度生长而导致的口腔微生态失衡[81, 82], 实现龋病的精准生态防控。STAMP在极大增强对特异性病原微生物清除作用的同时, 并不显著影响微生物群落生态平衡, 这一特点使其在细菌生物膜感染控制领域将具有广泛的应用前景。

5 口腔微生物组与口腔疾病治疗效果精准评估

现代医学高速发展的重要表现之一是治疗方法的不断涌现, 而新方法的有效性评估是进行临床推广的关键。口腔疾病治疗的临床疗效评估, 是对治疗所产生的效能和效率进行定性、定量和综合判断, 需要选取具有客观性、稳定性和可重复性的生物学指标。

近期研究[67]发现, 口腔微生物菌群结构的变化能够反映口腔卫生保健措施的临床效果。通过宏基因组学技术手段, 研究者比较了洁牙、使用含有抑菌成分的牙膏和漱口水、使用常规口腔护理牙膏3种不同的口腔卫生保健措施下的菌斑动态变化, 发现每一种口腔卫生保健措施均有特征性的口腔菌群变化:洁牙可导致最显著的菌群结构变化, 共有44个细菌属的丰度在治疗过程中显著改变; 在牙膏和漱口水相结合的干预措施中, 共有14个细菌属丰度显著改变; 常规使用牙膏刷牙仅可导致5个细菌属的丰度改变。基于上述研究, 研究者[67]以洁牙后菌群变化特征为参照, 构建了牙龈健康护理方案的“ 相对菌群恢复程度指数” (relative microbiota recovery index, RMRI)。这一指数不仅可以形象、客观地横向比较不同口腔干预方式的优劣, 还可纵向反映每种方式在处理过程中的菌群变化和临床效果。因此, 这种精准的“ 微生物组标尺” 可作为牙龈护理疗效评估和牙龈护理产品研发的客观标准。

6 整合口腔微生物组, 应对精准医疗的挑战

尽管口腔微生物组在疾病的预警、诊断、治疗、疗效评估方面的初步研究展示了其在精准医疗发展中的巨大潜力, 将微生物组信息纳入日常临床实践尚存在诸多挑战。

1)口腔微生物组的组成具有异质性, 这种可变性表现在个体间、个体内部不同时间点、口腔内不同位点间。此外, 口腔微生物组可受到宿主的年龄、地域、饮食、生活习惯(如吸烟)、自身基因等因素的影响。这些可导致微生物组组成改变的因素可能将一些与临床无关的“ 噪音” 引入微生物组相关数据, 进而导致对微生物组数据的错误解析。

2)不同的样本收集方法、存储方法、处理方法及试剂可导致结果差异, 进一步混淆生物学相关的个体变异。因此, 样本采集、存储、处理及试剂使用的标准化流程在保证口腔微生物组研究结果的可重复性方面显得尤为重要。

3)数据处理及释义同样可导致另一层次的混淆效应。当采用不同的分析工具对同一数据进行处理时, 得到的结果之间有出现偏差的可能性。此外, 对多病因的疾病进行微生物组学相关解释时, 识别临床混杂因素的难度较大。

4)口腔微生物组的可塑性对维持变化后的稳定性构成了挑战。微生物组组成和功能的改变仅仅是影响疾病发生、发展的诸多因素之一。因此, 只有通过整合微生物组、人体基因组及其他环境变量信息, 才能确保个体化精准医疗的成功实践。如何实现这一高度整合的医疗模式, 仍然是研究者所面临的难题与挑战。

精准医疗的目标在于降低疾病患病风险、改善诊疗、促进疗效、提高疾病预防。分析生理及病理状态下口腔微生物组, 寻找口腔微生物指纹, 建立基于口腔微生物组学大数据的疾病风险预测及治疗预后评估, 有望深入揭示口腔微生物组对口腔乃至全身健康的影响, 发挥其在疾病诊断及疗效预测中的优势, 推动精准医疗实践。

The authors have declared that no competing interests exist.

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