不同蔗糖浓度下外源性右旋糖酐酶与氟化钠对粘放线菌生物膜的影响
房宏志1, 田媛媛1,2, 喻譞2,3, 杨英明4, 杨惠5, 胡涛4
1.成都市第三人民医院口腔科 成都 610031
2.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心,四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科 成都 610041
3.宁波市鄞州人民医院口腔科 宁波 315040
4.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心,四川大学华西口腔医院预防口腔科 成都 610041
5.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心,四川大学华西口腔医院全科门诊 成都 610041
[通信作者] 杨惠,讲师,博士,Email:yanghui09@scu.edu.cn

[作者简介] 房宏志,副主任医师,硕士,Email:1127958575@qq.com

摘要

目的 探索在不同蔗糖浓度条件下,外源性右旋糖酐酶(Dex)与氟化钠(NaF)对粘放线菌生物膜的影响。方法 利用结晶紫染色法测定粘放线菌生物膜量。用二甲氧唑黄(XTT)法检测细菌生物膜的活性。用pH仪测定细菌培养初始液体培养基的pH值(pH1)及培养18 h后培养基的pH值(pH2),并计算ΔpH(pH1-pH2)。结果 在不同蔗糖浓度条件下,各组细菌生物膜量先随蔗糖浓度升高而增加,至蔗糖质量分数为0.5%时到达峰值,继而随浓度升高生物膜量减少;在蔗糖质量分数为1%时,Dex+NaF组生物膜量明显小于Dex组或NaF组。随着蔗糖浓度的增加,各组生物膜活性有降低趋势。相同蔗糖浓度下,Dex组生物膜活性与对照组相似( P>0.05);NaF组生物膜活性较之对照组有轻度增加( P<0.05)。随着蔗糖浓度增加,各组ΔpH变化趋势为先增大后减小;在蔗糖质量分数为0.25%~2%时,Dex和NaF单独使用及联合使用时均能抑制细菌产酸。结论 在本实验条件下,Dex和NaF对细菌生物膜的形成、生物膜活性及细菌产酸的作用受蔗糖浓度的影响。在蔗糖质量分数为1%时,Dex和NaF联用对粘放线菌生物膜形成的抑制作用表现出协同作用。在蔗糖质量分数为2%时,Dex和NaF能协同抑制细菌生物膜产酸。

关键词: 右旋糖酐酶; 氟化物; 生物膜; 蔗糖; 粘放线菌
中图分类号:R37    文献标志码:A       doi: 10.7518/gjkq.2017.06.006
The influence of exogenous dextranase and sodium fluoride on biofilm of Actinomyces viscosus under different sucrose concentration conditions
Fang Hongzhi1, Tian Yuanyuan1,2, Yu Xuan2,3, Yang Yingming4, Yang Hui5, Hu Tao4
1. Dept. of Stomatology, The Third People’s Hospital of Chengdu, Chengdu 610031, China;
2. State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Dept. of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China;
3. Dept. of Stomatology, Ningbo Yinzhou People’s Hospital, Ningbo 315040, China;
4. State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Dept. of Preventive Dentistry, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China;
5. State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Dept. of General Dentistry, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract

Objective To explore the impact of exogenous dextranase(Dex) and sodium fluoride(NaF) on the biomass, biofilm vitality and acid production of Actinomyces viscosus in different sucrose concentration substrate.Methods Crystal violet staining was used to quantify the biomass of A. viscosus in each group. 2,3 bis(2 methoxy 4 nitro 5 sulfophenyl) 5 [(phenylamino)carbonyl] 2H tetrazolium hydroxide(XTT) assay was used to detect the vitality of the bacterial biofilms. pH electrode was applied to measure the pH values of the initial(pH1) and the 18 h liquid culture medium(pH2), and then the ΔpH(pH1-pH2) values was calculated.Results Under different sucrose concentration conditions, the bacterial biomass increased with the increase of sucrose concentration, and reached the peak at a sucrose mass fraction of 0.5%, and then decreased with the increase of sucrose concentration. In the 1% sucrose mass fraction groups, the bacterial biomass formed in the Dex+NaF group was significantly less than in the Dex or NaF group. In all groups, the bacterial vitality was decreased along with the increased sucrose concentration. Under the same sucrose concentration, the bacteria vitality of the Dex group was similar to that of the control group( P>0.05), and there was a slight increase in the bacteria vitality in the NaF group compared with the control group( P<0.05). With the increase of sucrose concentration, ΔpH changes were first increased and then decreased. The single or combined use of NaF and Dex could inhibit the acid production of A. viscosus under the sucrose mass fraction ranged from 0.25% to 2%.Conclusion Sucrose concentration was one of the factors that can influence the effect of Dex and NaF, both single and combination, on the bacterial biomass, biofilm vitality and acid production. The inhibitory effect of the combined use of Dex and NaF on the formation of bacterial biofilm showed a synergistic effect at the sucrose mass fraction of 1%. Dex and NaF displayed synergistic effect on acid production at the sucrose mass fraction of 2%.

Keyword: dextranase; sodium fluoride; biofilm; sucrose; Actinomyces viscosus

龋病是一种发生在牙体硬组织上的慢性感染性疾病, 被世界卫生组织列为影响人类健康的三大疾病之一。目前, 氟化物防龋是被普遍接受且最为广泛应用的一种防龋方法, 但是氟化物防龋也存在着一定的局限性, 长期应用需考虑其安全性。龋病是一种生物膜依赖的疾病, 控制菌斑生物膜的形成是预防龋病发生的最根本途径。

笔者所在课题组在所完成的前期实验中探索了脱黏附剂右旋糖酐酶(dextranase, Dex)和氟化钠(sodium fluoride, NaF)联用对某些致龋菌生物膜的影响。结果[1, 2]发现, 外源性Dex与NaF联用能够协同抑制变异链球菌和粘放线菌生物膜的形成, 脱黏附剂和氟化物联用可能为龋病预防提供了一条新思路。

蔗糖是被公认的致龋性最强的碳水化合物, 其与龋病的关系已经被很多流行病学以及实验室研究[3, 4, 5]所证明。在细菌生物膜形成过程中, 蔗糖能够引起细菌的系列生理、生化反应, 增加细菌的致龋特性, 主要表现在:细菌酵解蔗糖产酸, 从而引起牙体硬组织脱矿; 细菌可利用蔗糖合成胞外多糖和胞内多糖, 胞外多糖能够促进细菌黏附聚集, 胞内多糖可在碳水化合物匮乏条件下为细菌提供营养来源; 蔗糖作为糖源时, 细菌生物膜内钙、磷和氟离子的浓度降低[6], 影响牙表面脱矿-再矿化的过程。研究[7, 8]表明, 蔗糖的致龋能力与蔗糖的浓度和暴露频率有关。

在前期实验条件下, Dex和NaF表现出协同抑制粘放线菌生物膜形成的作用, 该作用是否受蔗糖浓度的影响尚不清楚。于是, 本实验选取含蔗糖质量分数为0、0.25%、0.5%、1%和2%的胰蛋白胨酵母(tryptone yesat, TPY)培养基, 观察不同蔗糖浓度条件下, Dex和NaF单独及二者联用对粘放线菌生物膜形成的影响以及对细菌生物膜活性、细菌产酸的影响。

笔者所在课题组在所完成的前期实验中探索了脱黏附剂右旋糖酐酶(dextranase, Dex)和氟化钠(sodium fluoride, NaF)联用对某些致龋菌生物膜的影响。结果[1, 2]发现, 外源性Dex与NaF联用能够协同抑制变异链球菌和粘放线菌生物膜的形成, 脱黏附剂和氟化物联用可能为龋病预防提供了一条新思路。

蔗糖是被公认的致龋性最强的碳水化合物, 其与龋病的关系已经被很多流行病学以及实验室研究[3, 4, 5]所证明。在细菌生物膜形成过程中, 蔗糖能够引起细菌的系列生理、生化反应, 增加细菌的致龋特性, 主要表现在:细菌酵解蔗糖产酸, 从而引起牙体硬组织脱矿; 细菌可利用蔗糖合成胞外多糖和胞内多糖, 胞外多糖能够促进细菌黏附聚集, 胞内多糖可在碳水化合物匮乏条件下为细菌提供营养来源; 蔗糖作为糖源时, 细菌生物膜内钙、磷和氟离子的浓度降低[6], 影响牙表面脱矿-再矿化的过程。研究[7, 8]表明, 蔗糖的致龋能力与蔗糖的浓度和暴露频率有关。

在前期实验条件下, Dex和NaF表现出协同抑制粘放线菌生物膜形成的作用, 该作用是否受蔗糖浓度的影响尚不清楚。于是, 本实验选取含蔗糖质量分数为0、0.25%、0.5%、1%和2%的胰蛋白胨酵母(tryptone yesat, TPY)培养基, 观察不同蔗糖浓度条件下, Dex和NaF单独及二者联用对粘放线菌生物膜形成的影响以及对细菌生物膜活性、细菌产酸的影响。

笔者所在课题组在所完成的前期实验中探索了脱黏附剂右旋糖酐酶(dextranase, Dex)和氟化钠(sodium fluoride, NaF)联用对某些致龋菌生物膜的影响。结果[1, 2]发现, 外源性Dex与NaF联用能够协同抑制变异链球菌和粘放线菌生物膜的形成, 脱黏附剂和氟化物联用可能为龋病预防提供了一条新思路。

蔗糖是被公认的致龋性最强的碳水化合物, 其与龋病的关系已经被很多流行病学以及实验室研究[3, 4, 5]所证明。在细菌生物膜形成过程中, 蔗糖能够引起细菌的系列生理、生化反应, 增加细菌的致龋特性, 主要表现在:细菌酵解蔗糖产酸, 从而引起牙体硬组织脱矿; 细菌可利用蔗糖合成胞外多糖和胞内多糖, 胞外多糖能够促进细菌黏附聚集, 胞内多糖可在碳水化合物匮乏条件下为细菌提供营养来源; 蔗糖作为糖源时, 细菌生物膜内钙、磷和氟离子的浓度降低[6], 影响牙表面脱矿-再矿化的过程。研究[7, 8]表明, 蔗糖的致龋能力与蔗糖的浓度和暴露频率有关。

在前期实验条件下, Dex和NaF表现出协同抑制粘放线菌生物膜形成的作用, 该作用是否受蔗糖浓度的影响尚不清楚。于是, 本实验选取含蔗糖质量分数为0、0.25%、0.5%、1%和2%的胰蛋白胨酵母(tryptone yesat, TPY)培养基, 观察不同蔗糖浓度条件下, Dex和NaF单独及二者联用对粘放线菌生物膜形成的影响以及对细菌生物膜活性、细菌产酸的影响。

1 材料和方法
1.1 实验菌株

粘放线菌(Actinomyces viscosus)ATCC 15987由口腔疾病研究国家重点实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 菌液制备 细菌接种于含蔗糖质量分数1%的TPY固体培养基中, 于体积分数80% N2、20% CO2及37 ℃恒温培养复苏细菌48 h。挑取部分菌落革兰染色后, 用光学显微镜观察菌落形态, 证实无污染后, 用无菌接种环挑取经鉴定为纯培养的单个菌落置于含蔗糖质量分数1%的液体TPY培养基中增菌18 h。涂片检查为纯培养后, 将菌液在4 ℃、750g条件下离心15 min, 收集细菌, 用无菌生理盐水漂洗细菌2次, 再用比浊仪将细菌浊度调整为1.0 McFarland(相当于3× 108 mL-1)的标准菌液。

1.2.2 结晶紫染色 在蔗糖质量分数为0、0.25%、0.5%、1%和2%的液体TPY培养基中, 均设置以下分组(分组参照前期研究[2]结果):1)对照组; 2)40 μ g· mL-1 NaF组; 3)0.25 U· mL-1 Dex 组; 4)0.25 U· mL-1 Dex+40 μ g· mL-1 NaF组。制备好的菌液用无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)稀释后, 将不同蔗糖浓度培养基、菌液及处理因素加入96孔微量滴定板中, 使菌液终浓度为1× 105 mL-1, 且菌液与培养基+处理因素的体积比为1:9, 共计200 μ L。将培养板置于细菌培养箱中, 80% N2、20% CO2及37 ℃下厌氧培养28 h, 取出并吸去上清液后, 用无菌生理盐水漂洗生物膜, 去除浮游细菌, 风干。

在室温下, 每孔加入100 μ L 99%甲醇固定生物膜15 min, 吸去上清液, 风干; 然后每孔加入100 μ L结晶紫染料, 将生物膜染色20 min, 流水冲洗去除多余的染料, 风干; 最后, 每孔加入150 μ L 33%乙酸, 将吸附在生物膜上的结晶紫置换出来, 再将上清液转移至新的96孔微量滴定板内, 在590 nm波长下测量样本吸光度值。

1.2.3 二甲氧唑黄{2, 3 bis(2 methoxy 4 nitro 5 sulfophenyl) 5 [(phenylamino)carbonyl] 2H tetrazolium hydroxide, XTT}测定 将制备好的菌液用PBS稀释后, 将含蔗糖质量分数1%的TPY培养基和菌液按体积比9:1加入96孔微量滴定板, 使菌液终浓度为1× 105 mL-1, 总体积为200 μ L。将培养板置于细菌培养箱中, 于80% N2、20% CO2及37 ℃下厌氧培养28 h, 取出并吸去上清液后, 用无菌生理盐水小心漂洗生物膜, 去除浮游细菌, 此过程中避免破坏生物膜完整性。再按上述分组加入含不同蔗糖浓度的新鲜培养基和处理因素(总体积为200 μ L), 厌氧培养过夜。处理因素作用结束后, 吸去上清液, 用无菌生理盐水漂洗生物膜2次去除浮游细菌, 在避光条件下, 每孔加入预先配制的XTT-甲萘醌溶液和无菌生理盐水各100 μ L, 37 ℃下培养2~3 h后, 转移孔板内容物至微量离心管内, 13 000 r· min-1离心4 min, 再从每支离心管取100 μ L上清液至新的96孔微量滴定板内, 在490 nm波长下测量其吸光度值[9, 10]

1.2.4 pH值测定 将制备好的菌液用PBS稀释后, 将菌液、培养基以及处理因素按菌液与培养基+处理因素的体积比为1:9加入24孔板内, 使菌液终浓度为1× 107 mL-1, 每孔总体积为2 mL, 分组同上。实验样本准备两组, 一组用于直接测量0 h的初始pH值; 另一组则将培养板置于细菌培养箱中, 80% N2、20% CO2及37 ℃下厌氧培养18 h, 细菌在孔板底部形成初始生物膜, 测定18 h细菌培养基的终末pH值。

1.3 统计分析

实验数据采用SPSS 16.0软件包分析, 选用单因素方差分析的LSD双侧检验, 在α =0.05的情况下比较各组之间的差异有无统计学意义。

2 结果
2.1 对生物膜量的影响

本实验用结晶紫将生物膜染色后, 用乙酸将吸附在生物膜上的结晶紫置换出来, 用吸光度值来反映生物膜量。对照组和各实验组粘放线菌28 h生物膜量都先随蔗糖浓度升高而增加, 至蔗糖质量分数为0.5%时, 各组的生物膜量都达到最大值; 继而随着蔗糖浓度升高, 生物膜量又呈逐渐下降趋势(表1)。在不含蔗糖的培养基中, NaF组与对照组相比, 生物膜量基本一致, 结果差异无统计学意义(P> 0.05); Dex组与NaF+Dex组的生物膜量比对照组少, 差异有统计学意义(P< 0.05)。在蔗糖质量分数为0.25%、0.5%时, NaF组与NaF+Dex组的作用相似, 细菌形成的生物膜量减少, 与对照组相比差异有统计学意义; 但Dex组生物膜量与对照组几乎没有差异(P> 0.05)。当蔗糖质量分数为1%时, Dex和NaF组生物膜量与对照组相比均有减少, 差异有统计学意义(P< 0.05); Dex+NaF组生物膜量与单独作用相比显著减少(P< 0.05)。蔗糖质量分数为2%时, Dex组与Dex+NaF组生物膜量相似, 与对照组相比显著减少; NaF组生物膜量与对照组相比, 也有一定量的减少, 但是不如另外两组明显(表1)。

表 1 不同蔗糖浓度下各组粘放线菌形成的生物膜量 Tab 1 The Actinomyces viscosus biomass in each group under different sucrose concentrations
2.2 生物膜活性

XTT测定法是由生物膜内有活力的细菌将XTT染料代谢为水溶性的甲瓒, 溶液颜色由无色透明变为黄色或橙色, 颜色越深, 表明生物膜活性越强。再用比色法测定经过细菌代谢的XTT溶液的吸光度值, 以吸光度值大小反映生物膜活性的高低, 溶液吸光度值与生物膜活性呈正比。在蔗糖质量分数为0~1%的培养基中, 对照组和实验组细菌生物膜活性均随蔗糖浓度升高而降低, 当蔗糖质量分数为1%时, 活性降至最低; 当蔗糖浓度继续升高时, 各组细菌生物膜活性表现出轻微的增强趋势。在不加入蔗糖条件下, NaF、Dex及NaF+Dex组细菌生物膜活性与对照组相比差异无统计学意义(P> 0.05)。在蔗糖质量分数为0.25%~ 2%时, Dex组生物膜活性与对照组相比差异无统计学意义(P> 0.05); 而NaF组和NaF+Dex组的作用相似, 与对照组相比生物膜活性略有增加, 且差异有统计学意义(P< 0.05)(表2)。

表 2 不同蔗糖浓度下各组粘放线菌生物膜活性 Tab 2 The vitality of the Actinomyces viscosus biofilms in each group under different sucrose concentrations
2.3 细菌产酸

取0 h及生长18 h粘放线菌液体培养基, 将pH仪电极浸入培养液中, 测定pH值, 计算各组生长18 h的pH值(pH2)与初始pH值(pH1)之间的变化△ pH(pH1-pH2), 见表3。无论对照组还是实验组, △ pH随蔗糖浓度升高而增大, 在蔗糖质量分数为0.5%或1%时达到最大值; 当蔗糖浓度继续升高时, △ pH值呈现缓慢下降趋势。在蔗糖质量分数为0.25%、0.5%、1%和2%时, Dex和NaF单独作用以及联用时, pH值变化与对照组相比均有统计学意义(P< 0.05), NaF组△ pH值均小于Dex组(P< 0.05); 在蔗糖质量分数为2%时, Dex+NaF组△ pH值较两者单用时明显减小(P< 0.05)。

表 3 不同蔗糖浓度下各组粘放线菌培养基pH值变化情况 Tab 3 The pH changes of the Actinomyces viscosus culture mediumin in each group under different sucrose concentrations
3 讨论

曾有学者[11]研究蔗糖浓度与变异链球菌细菌黏附和生物膜形成的关系, 发现细菌的黏附与生物膜形成能力先随蔗糖浓度增加而增强, 到达一个转折浓度后再随浓度增加而减弱。本实验结果与上述研究相似, 发现各组细菌生物膜量均先随蔗糖浓度升高而增加, 到蔗糖质量分数为0.5%时均达到最大值, 然后再随蔗糖浓度升高而减少。结果表明适宜的蔗糖浓度能够促进细菌生物膜的形成, 高浓度蔗糖会抑制生物膜的形成。

本实验结果显示, 在加入蔗糖的培养条件下, NaF均表现出抑制细菌生物膜形成的作用, 其作用机制可能是通过影响葡糖基转移酶的合成-分泌过程, 减少水不溶性葡聚糖的合成, 从而影响细菌黏附聚集[12]。Dex是一种葡聚糖水解酶, 通过切断α -1, 6糖苷键将葡聚糖分解为单糖[13, 14], 且能够通过改变α -1, 6和α -1, 3糖苷键的比例来改变多糖的水溶性和黏性。葡聚糖是细菌胞外多糖的组成成分之一, 与细菌黏附聚集有着密切的关系。在蔗糖质量分数为0.25%、0.5%的培养条件下, Dex对粘放线菌生物膜的形成未表现出抑制作用, 可能因为蔗糖浓度在一定范围内升高, 使细菌合成胞外多糖的能力增强, 并远远超过0.25 U· mL-1 Dex对胞外多糖的水解能力; 蔗糖浓度还影响细菌生物膜三维空间结构[11], 可能导致Dex与胞外葡聚糖作用位点接触不充分, 因此导致其水解能力大大减弱, 但具体机制尚需研究。在蔗糖质量分数为1%时, 细菌形成生物膜的能力已经开始下降, Dex和NaF单独使用均表现出一定的抑制细菌生物膜形成的作用, 两者联用表现出协同抑制作用, 此结果与前期研究[2]结果一致。当蔗糖质量分数达到2%时, 与对照组相比, Dex使生物膜量下降99%, Dex与NaF联用未表现出协同抑制作用。

XTT法被广泛用于测定细菌和真菌浮游状态及生物膜状态下的活性[15, 16], 本实验用XTT法检测细菌生物膜活性。结果表明, 在无蔗糖培养基中生物膜的活性最高, 随着蔗糖浓度升高, 各组细菌生物膜活性均表现出减弱趋势。推测其原因可能是随蔗糖浓度升高, 细菌代谢蔗糖增多, 产生的大量代谢产物使细菌生物膜微环境改变, 从而影响生物膜内细菌活性。在各蔗糖浓度培养条件下, Dex组与对照组生物膜活性差异无统计学意义(P> 0.05), 提示低浓度(0.25 U· mL-1)Dex在一定条件下对粘放线菌成熟生物膜的活性无影响。有研究[17]表明, 低浓度(质量分数为5× 10-5)氟对变异链球菌的生物膜细菌活性没有影响。但在本实验中, 40 μ g· mL-1 NaF能使粘放线菌生物膜活性轻微增加, 这可能与实验方法及设计不同有关。

牙菌斑内细菌通过代谢蔗糖, 能够迅速产生乳酸, 导致菌斑内pH值下降, 这是牙菌斑致龋的一个必要条件[18]。本实验结果中, △ pH值代表细菌产酸能力, 其值越大, 表明细菌产酸越多。随着蔗糖浓度升高, 各组细菌生物膜产酸能力增强, 蔗糖质量分数达到0.5%(NaF组, Dex+NaF组)或1%(对照组, Dex组)时又逐渐减弱。在蔗糖质量分数为0.25%、0.5%、1%、2%的培养条件下, NaF表现出明显的抑制粘放线菌产酸的作用。早在1983年, Hamilton等[19]研究发现NaF能抑制粘放线菌产酸, NaF主要通过以下途径影响细菌产酸:1)抑制糖酵解有关的酶的活性, 减少磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)的合成, 从而减少PEP-磷酸转移酶系统所介导的细菌对糖源的摄入, 减少产酸; 2)抑制细胞膜结合的H+/腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase, ATPase)活性, 从而抑制细胞将H+排出细胞外[20]; 3)增加细菌细胞膜对H+的渗透性, 使H+更易于进入细胞内, 而降低细胞外pH值[17]。本实验条件下, Dex表现出轻微的抑制粘放线菌生物膜产酸的作用, 这可能与其抑制细菌生物膜的形成有关。在蔗糖质量分数为0.25%、0.5%和1%时, Dex+NaF联用对细菌产酸的抑制作用与NaF相似(P> 0.05); 但蔗糖质量分数为2%时, Dex和NaF联用对细菌生物膜的产酸抑制表现出协同效应, 可能仍然与蔗糖浓度改变导致的胞外多糖及生物膜构架改变有关, 具体机制尚需进一步研究。

综上, 蔗糖浓度影响粘放线菌的生物膜形成、生物膜活性及产酸, Dex和NaF对粘放线菌生物膜的作用也与蔗糖浓度有关。这是由细菌、蔗糖浓度、处理因素等多方面共同调节的结果, 但确切的作用机制还需要进一步的研究。本实验为进一步探索Dex和NaF的防龋作用和远期应用条件提供了一定的理论基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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