CD20在口腔潜在恶性病变中的表达及其临床意义
刘奕1,2, 周昊1, 费伟1
1.四川省医学科学院•四川省人民医院•电子科技大学附属医院口腔科 成都 610072
2.英属哥伦比亚大学牙学院口腔生物医学科学系 温哥华 BC V6T 1Z3
[通信作者] 费伟,主任医师,博士,Email:fwross10@sina.com

[作者简介] 刘奕,副主任医师,博士,Email:liuyi82404@hotmail.com

摘要

目的 从组织学层面上探究B淋巴细胞特有的表面标记物CD20在口腔潜在恶性病变(OPMD)组织中的表达情况,评估CD20在口腔黏膜组织癌变过程中的表达规律及其临床意义。方法 采用回顾性分析研究的方法,分别分析17例上皮增生、21例口腔扁平苔藓(OLP)、15例上皮轻度异常增生(D1)、9例上皮中度异常增生(D2)共计4组样本的临床资料,采用免疫组织化学染色(IHC)技术检测各组病理组织中CD20的表达情况,分析CD20的表达与病理分型以及各临床因素之间的关系。结果 在上皮增生、OLP、D1、D2四组样本中,CD20阳性染色率分别为11.76%、61.90%、20.00%、66.67%,组间差异有统计学意义( P<0.05)。CD20的阳性表达与年龄、性别、部位、吸烟饮酒史等因素均无相关性( P>0.05)。多因素分析结果显示,将上皮增生组作为参考时,OLP组和D2组的比值比升高,差异有统计学意义( P<0.05)。结论 CD20可以作为一项评估OPMD恶性转化潜能的临床指标。

关键词: CD20; B细胞; 口腔潜在恶性病变
中图分类号:R781.5    文献标志码:A      
Clinical significance of CD20 expression in oral potentially malignant disorders
Liu Yi1,2, Zhou Hao1, Fei Wei1
1.Dept. of Stomatology, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Affiliated Hospital to University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610072, China
2.College of Oral Biological and Medical Sciences, Faculty of Dentistry, University of British Columbia, Vancouver BC V6T 1Z3, Canada
Abstract

Objective This study aims to investigate the expression of C20 in oral potentially malignant disorders (OPMDs) by using the histological analysis and evaluates the clinical value of using CD20 as indices to assess the carcinogenic potential of OPMDs.Methods Clinical data from 17 cases with oral hyperplasia mucosa, 21 cases with oral lichen planus (OLP), 15 cases with mild oral dysplasia mucosa (D1), and 9 cases with mild moderate dysplasia mucosa (D2) were analyzed by using retrospective analysis. Immunohistochemical analysis was applied to investigate the expression of CD20 in paraffin sections of oral hyperplasia mucosa, OLP, D1, and D2 tissues. Subsequently, the relationships between such expression and clinical factors were investigated.Results Results The positive rates of CD20 expression in the oral hyperplasia mucosa, OLP, D1, and D2 mucosa were 11.76%, 61.90%, 20.00%, and 66.67% ( P<0.05), respectively. CD20 expression was found uncorrelated with age, gender, region, alcohol use, and smoking status ( P>0.05). The multiple-factor analysis showed that the odds ratios of OLP and D2 significantly increased ( P<0.05) when oral hyperplasia mucosa was used as the reference group.Conclusion CD20 may be used individually as clinical index to evaluate the carcinogenic potential of OPMDs.

Keyword: CD20; B cell; oral potentially malignant disorders

口腔潜在恶性病变(oral potentially malignant disorder, OPMD)是一类发生在口腔黏膜、具有癌变潜能的疾病总称[1]。2005年, 世界卫生组织建议取消口腔癌前病变和癌前状态的区别, 将它们统称为“ 潜在恶性病变” 。其中, 口腔扁平苔藓(oral lichen planus, OLP), 口腔白斑病(oral leukoplakia, OLK)和口腔红斑病(oral erythro-plakia, OEK)等病变也归入OPMD范畴[1, 2, 3]

一般认为, 从正常细胞发展到肿瘤细胞, 都要经历从正常-增生-异常增生-原位癌-浸润癌的过程, 而异常增生则是从良性改变到恶性改变的中间站。

目前, 病理学上认定一个潜在恶性病变就是看其是否存在上皮异常增生, 有上皮异常增生者意味着以后病变进展为癌的可能性大[4]。由于大多数口腔鳞状细胞癌是由OPMD转化发展而来, 如能在疾病尚处于OPMD阶段及时评估其癌变危险性, 则可为口腔鳞状细胞癌早期的干预治疗提供良机[5, 6]

B淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞, 主要执行机体的体液免疫。CD20是B细胞特有的表面标记, 它出现于前B细胞和成熟B细胞, B细胞激活分化将导致CD20的高表达, B细胞分化至成熟的浆细胞时, CD20表达消失。

本研究欲采用回顾性分析研究方法从组织学层面上探究OPMD组织中B淋巴细胞的标记物CD20的表达情况, 统计分析其相互关系及与各临床因素之间的关系, 探寻CD20在口腔黏膜组织癌变过程中的表达规律及其临床意义, 进一步评估其作为检测OPMD恶变潜能和早期治疗的价值。

1 材料和方法
1.1 病例收集

本研究所选用的甲醛固定石蜡包埋(formalin- fixed paraffin-embedded, FFPE)活检标本来自于加拿大温哥华总医院病理科数据库(1996— 2015年), 共计57例OPMD患者(女27名, 男35名)的62例标本, 病变部位分别为舌30例, 颊黏膜13例, 牙龈8例, 其他(腭部或口底)11例; 饮酒史分别为无/轻度32例, 重度(男性饮酒量> 3杯· d-1, 女性饮酒量> 2杯· d-1)5例, 未知25例; 吸烟史分别为无23例, 曾经吸过12例, 现在在吸19例, 未知8例。

所有观察对象在初次诊断后均有至少5年的观察期, 且无其他部位肿瘤病史。

1.2 样本制备和实验分组

将62例FFPE样本制备组织切片, 按标准苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色法进行染色, 制备好的切片由高年资病理科医生在光学显微镜下按病理学分类进行分组:上皮增生组17例, OLP组21例, 上皮轻度异常增生15例记为D1组, 上皮中度异常增生9例记为D2组。

1.3 免疫组织化学(immunochemistry, IHC)染色

组织切片的制作和检测:所有蜡块标本均切片4张, 厚度4 μ m, 贴于防脱片, 60 ℃烘烤2 h备用。将石蜡切片按常规方法进行脱蜡, 水合(二甲苯2× 10 min, 100%乙醇2× 3 min, 95%乙醇2× 3 min)。

抗原修复完成后, 将切片置于0.5%过氧化氢溶液中作用5 min以消除内源性过氧化物酶活性, 10%山羊血清封闭切片10 min, 滴加一抗CD20(DAKO公司, 丹麦), 1:300稀释, 室温孵育30 min。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(DAKO公司, 丹麦), 室温孵育40 min。

新鲜配制质量分数为0.04%的3, 3-二氨基联苯胺显色1~5 min, 镜下控制反应时间; 苏木素复染, 脱水, 中性树胶封片。扁桃体组织作为阳性对照, 磷酸盐缓冲液(phosphatebuffered saline, PBS)代替一抗作为阴性对照。

将IHC染色的组织切片置于Pannoramic MIDI切片扫描仪(3D Histech公司, 匈牙利)载物台上进行扫描分析, 放大倍数为20倍, 分析软件为Pa-noramic viewer(3D Histech公司, 匈牙利)。

1.4 结果分析

在BH2-RFCA型光学显微镜(Olympus公司, 日本)下将切片分为2个研究区域:上皮内和上皮下。CD20的IHC染色结果:细胞膜出现黄色或棕黄色的颗粒判定为阳性细胞, 不着色判定为阴性细胞。

染色结果分别由2名高年资病理科医师独立进行判读, 结果差异时由2位医师讨论后获得一致性, 采用双评分半定量积分法进行评分, 记录阳性细胞比例和染色强度。

在高倍镜(× 400)下随机选择5个视野, 每个视野平均观察100个细胞, 根据阳性细胞比例的平均值分为4级:阳性细胞≤ 10%记为0分, 11%~ 30%记为1分, 31%~60%记为2分, 阳性细胞≥ 60%记为3分, 评分大于0则视为染色阳性。

1.5 统计分析

所得数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。

2 结果
2.1 CD20在OPMD各组组织中的表达

图1为OPMD各组的HE染色, 图2为CD20在OPMD各组中的IHC染色, 结果示:CD20阳性染色定位于细胞膜, 呈棕黄色或棕褐色, 染色较深, 胞浆少, 核较大。

图 1 OPMD各组的HE染色图片 × 200
A:上皮增生组, B:OLP组, C:D1组, D:D2组。
Fig 1 HE staining pictures of all groups of OPMDs × 200

图 2 CD20在OPMD各组中的IHC染色
A~D:放大比例为200倍, 比例尺为100 μ m; E~H放大比例为400倍, 比例尺50 μ m。A、E:上皮增生组; B、F:OLP组; C、G:D1组; D、H:D2组。
Fig 2 IHC staining of OPMDs with the CD20

CD20在上皮增生和D1组的组织中阴性表达, 在OLP和D2组的组织中呈阳性表达, 阳性着色主要集中在上皮下固有层内, 上皮内基本不表达CD20。

2.2 IHC染色结果分析

根据染色分值及染色阳性率进行统计分析, 结果如表1所示。OPMD组间比较, 上皮增生组、OLP组、D1组、D2组的阳性染色率分别为:11.76%、61.90%、20.00%、66.67%, 差异有统计学意义(P=0.001 3< 0.05)。由表2可以看出, CD20阳性表达与临床因素年龄、性别、部位、吸烟饮酒史均无相关性(P> 0.05)。在进行病理分型多因素分析时, 在未考虑混杂因素的情况, 将上皮增生组作为参考时, OLP组和D2组的比值比(odds ratio, OR)升高, 差异有统计学意义(P< 0.05, OLP和D2组P值分别0.005 0和0.008 7)。

表 1 CD20在不同病理组织间的表达 Tab 1 The expression of CD20 in different patholo-gical tissues 例
表 2 CD20表达与OPMD患者临床资料的关系 Tab 2 Comparison of CD20 expression in clinicopa-thological characteristics of the patients with OPMDs
3 讨论

上皮异常增生是一个组织病理学名词, 是OPMD的一大病理学特征, 其主要表现既有细胞群体的变化, 又有细胞本身的改变, 细胞学改变包括上皮分层不规则, 基底细胞极性丧失, 滴状钉突, 核分裂数增加, 异常的浅层分裂, 单个细胞成熟前角化(错角化)及钉突内出现角化珠等。上皮结构改变包括增生的细胞大小不一, 细胞形态异常变化(细胞的多形性), 细胞核大小的异常变化, 细胞核形态的异常变化(核多形性), 核质比例增加, 细胞核增大, 核仁增大, 不典型分裂像, 数量增加及核深染等[3, 7]。上皮异常增生被认为是OPMD发展为口腔鳞状细胞癌的高危因素, 但某些OPMD, 例如OLP, 其组织学检查常不伴有上皮异常增生, 仍具有恶变潜能[8], 倘若能早期检测OPMD的发生和恶性转化, 将对降低OPMD癌变率具有重要意义。本研究通过检测CD20细胞在OPMD不同病理分型组织中的表达情况, 统计分析其相互关系及与各临床因素之间的关系, 探究CD20在口腔黏膜组织癌变过程中的表达规律及其临床意义。

本研究的免疫组织化学及统计学分析结果显示, CD20在上皮增生和上皮轻度异常增生的组织中基本不表达, 随着上皮异常增生程度的增加, CD20+细胞比例和染色强度逐渐增加, 且阳性着色主要集中在固有层内, 上皮内基本不表达CD20。值得注意的是, OLP组织虽然上皮异常增生率低, 但在本研究中发现CD20在OLP组织的固有层内也呈阳性表达, 染色主要集中于固有层内的淋巴细胞浸润带内, 远离基底膜侧。

OLP是一种T细胞介导的口腔黏膜非感染性慢性炎症, 大量研究[9, 10]表明, OLP患者罹患口腔鳞状细胞癌的风险概率比正常人群高出约10倍, 大多在被诊断为OLP后的第6年左右开始发生癌变。OLP典型病理特征为上皮不全角化, 基底细胞液化变性, 及固有层有密集的淋巴细胞浸润带。淋巴细胞浸润带中虽以T细胞为主, 但也有少量的B淋巴细胞[11]。B细胞是体内主要产生抗体的细胞, 基本功能是当机体受抗原刺激后, B细胞分化为浆细胞, 产生并分泌免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)抗体, 参与体液免疫[12]。研究发现, 肿瘤组织中有浸润的B细胞, 肿瘤浸润B细胞可以产生一种IgG抗体来识别肿瘤组织中的某种抗原, 使其对肿瘤的生长起到一定的抑制作用。此外, B细胞本身也是一种抗原呈递细胞。在体内它通过其表面的Ig将外源蛋白尤其是低浓度的抗原呈递给T细胞。B细胞通过与其他接触产生细胞因子参与免疫调节造血及炎症反应。以往认为B细胞可能与基底膜区IgG、IgM沉积有关, 尽管尚不能确定基底膜区IgG、IgM是局部淋巴细胞所分泌, 但这种Ig抗体与抗原结合, 形成免疫复合物沉积于基底膜区, 在补体参与下造成基底膜破坏, 导致基底细胞液化变性, 可能是引起OLP迁延难愈的原因之一。

CD20抗原是一种B细胞分化抗原, 仅位于前B细胞和成熟B细胞, 它在95%以上的B细胞性淋巴瘤中表达, 而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达, 单核细胞、静息或活化的T细胞、裸细胞及非淋巴细胞均不表达CD20分子。以往研究发现, 在OLP病损中, CD20+细胞的检出率为74.3%。本研究结果显示, CD20+B细胞在上皮增生和上皮轻度异常增生组织中不存在, 而在OLP和上皮中度异常增生组织中存在且位于淋巴细胞浸润带, 提示B细胞在OPMD发生发展过程中可能发挥一定作用。OPMD病理分型分组结果显示CD20的表达与病变的病理分型相关(P< 0.05), 异常增生程度越高, 癌变风险越高, CD20表达越强, 在进行病理分型多因素分析时, 将上皮增生组作为参考时, OLP组和D2组的OR值差异有统计学意义(P< 0.05), 这就提示CD20作为评估恶性转化潜能的指标具有一定的临床意义。此外, 在CD20与临床各因素相关性分析中, 其表达与患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史及病变部位均无相关性(P> 0.05)。

以往研究认为, 在口腔黏膜疾病的不同阶段, 免疫系统可能会感受到OPMD中异常增生细胞早期的转变, 并对细胞这一转变做出反应。本课题组目前正在进一步研究部分重要免疫细胞及相关细胞因子(T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、白细胞介素等)在OPMD上皮细胞异常增生不同分级以及原位癌的情况下免疫细胞浸润分布的基本概况, 统计分析免疫细胞和相关细胞因子在疾病不同阶段时的变化关系, 疾病相同阶段时不同细胞之间的相互关系, 及各变化与各临床因素之间的关系, 进一步评估它们作为检测OPMD恶变潜能和早期诊断指标的价值。

The authors have declared that no competing interests exist.

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