成骨细胞条件性 FoxO1基因敲除糖尿病小鼠模型的建立
熊毅, 宫苹, 伍颖颖
口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心;四川大学华西口腔医院种植科 成都 610041
[通信作者] 伍颖颖,副教授,博士,Email:yywdentist@163.com

[作者简介] 熊毅,硕士,Email:xiongraise@163.com

摘要

目的 建立成骨细胞条件性 FoxO1基因敲除的糖尿病小鼠模型,并进行初步的表型研究。方法 设计基因敲除策略,获得野生型和纯合小鼠。提取鼠尾组织DNA,经聚合酶链式反应(PCR)扩增后鉴定其基因型。分别提取小鼠原代成骨细胞mRNA和蛋白质,以及其他组织的mRNA,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot技术检验 FoxO1的表达。在不同时间点监测小鼠体重、血糖,并进行胰岛素耐受实验。结果 成功建立 FoxO1基因敲除小鼠模型并诱发糖尿病,糖尿病小鼠从第2周开始体重明显低于正常小鼠。在糖尿病条件下,纯合小鼠血糖值明显低于野生型小鼠,其胰岛素敏感性明显高于野生型小鼠。结论 成功建立了成骨细胞条件性 FoxO1基因敲除小鼠模型; FoxO1基因敲除可改善糖尿病小鼠的高糖血症,可能是由于 FoxO1基因敲除增加了糖尿病小鼠的胰岛素敏感性。

关键词: 叉头转录因子; 条件性基因敲除; 糖尿病
中图分类号:R78    文献标志码:A      
Establishment of diabetic mouse model with conditional knockout of FoxO1 in osteoblasts
Xiong Yi, Gong Ping, Wu Yingying
State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Dept. of Implantology, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract

Objective This study aims to establish a diabetic mouse model with conditional knockout of FoxO1 in osteoblasts and preliminary explore the phenotypes.Methods Wild type (WT) and gene knockout mice were obtained according to the designed reproductive strategy. DNA was extracted from mouse tail and amplified by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The mice phenotypes were also detected. The mRNA and protein levels of FoxO1 in osteoblasts and other tissues were obtained and detected by RT-PCR and Western blot analysis. Mice weight and fasting blood glucose were measured. Insulin tolerance test (ITT) was conducted to assess the role of FoxO1 in glucose metabolism.Results Diabetic mouse models with conditional knockout of FoxO1 in osteoblasts were successfully established. The body weight of diabetic mice was significantly lower than that of normal mice at 2 weeks. The fasting blood glucose in diabetic gene knockout mice was lower than that in diabetic WT mice. In addition, ITT showed that FoxO1 knockout promoted insulin sensitivity in diabetic gene knockout mice compared with that in diabetic WT mice.Conclusion Diabetic mouse model with conditional knockout of FoxO1 in osteoblasts was successfully established. FoxO1 knockout ameliorated hyperglycaemia, which may be accounted for the increased insulin sensitivity in diabetic gene knockout mice.

Keyword: forkhead box protein O; conditional knock-out; diabetes mellitus

叉头转录因子(forkhead box protein O, FoxO)包括4个亚型FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6[1], 可通过调节细胞因子和生长因子信号, 发挥调节细胞增殖、分化、葡萄糖异生和氧化应激等多种生物学功能的作用[2, 3]。炎症可激活骨源细胞中的FoxO1, 调控细胞因子分泌, 从而导致细胞凋亡[4]。FoxO1与成骨细胞的活性紧密相关, 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)-2刺激人间充质干细胞, 使FoxO1 mRNA表达显著提高。

此外, 通过慢病毒转染而过表达FoxO-1可以显著提高碱性磷酸酶启动子活性[5, 6]。动物实验结果显示, FoxO1在骨形成中发挥重要作用, 有研究[7]通过敲除成骨细胞中的FoxO1基因, 证实FoxO1可通过调节成骨前体细胞活性, 促进细胞增殖, 但是FoxO1对细胞分化能力没有影响。另有研究[8]通过敲除成骨样细胞中FoxO1、FoxO3和FoxO4基因, 从而证实对应的转录因子FoxO1、FoxO3、FoxO4可通过调节细胞分化能力促进骨生成。

FoxO1另一种重要作用则是调节机体氧化应激状态。活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)可激活FoxO1转录因子, 进而通过调节基因的转录水平来调节机体ROS水平。此外, FoxO还可以通过上调抗氧化物基因表达水平来调节机体氧化应激状态[9]

糖尿病(diabetes mellitus)是一种以高血糖为主要临床表现的内分泌代谢性疾病。糖尿病患者往往伴发不同程度的并发症, 其中包括心血管疾病、糖尿病肾病、视网膜病变以及神经系统障碍等。研究[10]表明, 糖尿病患者多伴有骨代谢障碍, 可引起骨量减少、骨质疏松, 甚至骨折。然而, FoxO1在糖尿病引起的氧化应激状态下发挥着怎样的作用以及其对骨代谢有何影响尚缺乏依据。

为了进一步探讨在糖尿病状态下, FoxO1对骨代谢的影响, 笔者建立了条件性FoxO1基因敲除糖尿病小鼠模型, 并在mRNA和蛋白质水平进行了验证, 为后续表型研究奠定了基础。

1 材料和方法
1.1 实验动物

实验用小鼠购买自Jackson Laboratory(美国), 小鼠的品系分别为FoxO1fl/fl(#024756; FVB.129S6(Cg)-Foxo1< tm1Rdp> /J)和Cre+/-(#019509; B6N.FVB-Tg(BGLAP-cre)1Clem/J)。动物实验均在口腔疾病研究国家重点实验室完成, 实验方案得到实验动物使用管理委员会批准。

1.2 小鼠的饲养和繁殖

小鼠由口腔疾病研究国家重点实验室管理饲养, 室内温度控制在20~25 ℃, 湿度50%~60%, 使用啮齿类动物繁殖饲料进行饲养。首先, 小鼠按雄雌1:3比例合笼交配, 将FoxO1fl/fl小鼠和BGLAP-Cre+/-小鼠杂交获得FoxO1fl/-Cre+/-小鼠, 再将此类小鼠和FoxO1fl/fl小鼠交配而获得成骨细胞FoxO1特异性敲除小鼠(FoxO1fl/flCre+/-; 纯合小鼠), 同窝出生的FoxO1fl/flCre-/-小鼠作为野生小鼠。

1.3 小鼠基因型鉴定

1.3.1 DNA提取及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定基因型 剪取2 mm小鼠尾尖, 置于1.5 mL离心管中, 加入0.5 mL裂解液[100 mmol· L-1三羟甲基氨基甲烷(trihydroxymethyl aminomethane, Tris; Sigma公司, 美国), pH8.0; 5 mmol· L-1乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetra acetic acid, EDTA; Sigma公司, 美国), pH8.0; 0.2%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS; Sigma公司, 美国); 200 mmol· L-1 NaCl]及10 mg· mL-1蛋白酶K(Merck公司, 德国), 55 ℃摇床上裂解2 h, 12 000g离心3 min; 吸取上清液加至另一干净1.5 mL Eppendorf管, 加0.5 mL异丙醇沉淀DNA, 再次以12 000g离心3 min, 弃上清液; 加入0.5 mL TE缓冲液(10 mmol· L-1 Tris, 1 mmol· L-1 EDTA, pH8.0)溶解DNA沉淀, 吸取2 μ L用于PCR检测。

根据目的基因片段的序列, 设计并合成FoxO1fl和Cre的成对引物(表1), 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

表 1 小鼠PCR相关引物 Tab 1 Primers for PCR analysis

对于FoxO1fl基因片段, 其扩增程序为94 ℃ 4 min; 94 ℃ 25 s, 62 ℃ 25 s, 72 ℃ 30 s, 38个循环; 72 ℃ 3 min; 4 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳后, 当扩增产物仅在300 bp处出现条带时, 该小鼠基因型为FoxO1fl/fl; 当扩增产物仅在247 bp处出现条带时, 该小鼠基因型为FoxO1-/-; 当扩增产物在300和247 bp同时出现条带时, 该小鼠基因型为FoxO1fl/-。对Cre基因片段, 其扩增程序为94 ℃ 2 min; 94 ℃ 20 s, 63 ℃ 15 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环; 72 ℃ 2 min; 4 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳后, 当扩增产物在300 bp处有条带时, 其基因型为Cre+/-; 若没有条带, 则其基因型为Cre-/-。1.3.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)检测FoxO1 mRNA水平 用外置块法培养原代成骨细胞, 经差速贴壁法提纯成骨细胞, 取第3代细胞进行验证。用Trizol(Invitrogen公司, 美国)提取成骨细胞mRNA, 采用Prime-ScriptTM RT reagent Kit试剂盒(Takara公司, 日本), 按说明书将1 μ g提取的mRNA逆转录成cDNA。逆转录反应程序为37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s, 4℃ 10 min。再使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara公司, 日本)对cDNA进行扩增。扩增反应程序为95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 31 s, 40个循环; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min。FoxO1引物序列见表1。采用2-△ △ Ct对结果进行半定量计算。

1.3.3 Western blot检测 为了验证FoxO1表达水平, 进一步完成了Western blot检测。首先, 使用凯基全蛋白质提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司), 严格按照说明书提取成骨细胞全蛋白质。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白质测定法进行定量分析, 加入上样缓冲液, 沸水浴5 min灭活蛋白质。

随后, 根据蛋白质定量分析结果, 吸取等量蛋白质(50 μ g)进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electropheresis, PAGE)(Bio-Rad公司, 美国), 电压200 V电泳1 h。

再将凝胶中分离开的蛋白质转移到PVDF膜(Millipore公司, 美国)上, 5%牛血清白蛋白(Sigma公司, 美国)封闭1 h, 孵育兔抗FoxO1一抗(1:1 000; 上海Santa Cruz公司), 4 ℃过夜。第2 d, 室温放置1 h复温后, 用含有Tween-20的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution with Tween-20, PBST)洗涤PVDF膜3次, 每次10 min; 室温下孵育山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobu-lin, Ig)G二抗1 h(1:2 000; 北京中杉金桥生物技术有限公司), PBST再洗涤3次, 显色曝光。

1.4 糖尿病小鼠动物模型建立

选取经鉴定的纯合和野生雄性小鼠, 腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ; Sigma公司, 美国)以破坏胰岛β 细胞。具体步骤如下:取26 mL 0.1 mol· L-1柠檬酸溶液和24 mL 0.1 mol· L-1柠檬酸三钠溶液混合, 加蒸馏水定容至100 mL, 形成50 mmol· L-1 pH4.5的柠檬酸缓冲液。将STZ溶解于新鲜配制的柠檬酸缓冲液中, 冰浴保存。注射前, 小鼠禁食4 h, 按照40 mg· kg-1的剂量给予小鼠进行腹腔注射, 正常进食并给予10%蔗糖水。按上述方法连续注射5 d后, 将10%蔗糖水更换为常规水, 14 d后, 禁食6 h后检测血糖, 血糖水平> 16.67 mmol· L-1即视为建模成功[11]。挑选10只野生小鼠和10只纯合小鼠诱导糖尿病(野生-糖尿病组; 纯合-糖尿病组), 选取10只正常的野生小鼠(野生组)和纯合小鼠(纯合组)作为阴性对照。

1.5 小鼠生理指标检测

1.5.1 体重 在整个实验过程中, 以最后一次注射STZ为开始计时, 分别在1、2和4周时间点检测各组小鼠体重。

1.5.2 血糖 每周第1 d禁食过夜后, 在第2 d上午8点检测小鼠空腹血糖。取小鼠尾静脉血, 采用葡萄糖-氧化酶法检测小鼠空腹血糖。

1.5.3 胰岛素耐受实验 在第4周时间点, 小鼠禁食6 h后, 腹腔注射胰岛素(0.5 U· kg-1; 徐州万邦生化医药公司), 分别在注射后15、30、60和90 min检测血糖值。胰岛素耐受实验(insulin tolerance test, ITT)结果以与初始血糖值的百分比表示。

1.6 数据处理及统计学分析

实验数据以均数± 标准差呈现。利用SPSS 17.0进行统计学分析。两组之间的统计学差异分析采用t检验; 3组及3组以上的统计学差异分析采用方差分析。P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 条件性FoxO1基因敲除小鼠的获得及小鼠基因型鉴定

为了验证繁殖获得的小鼠的基因型, 提取鼠尾DNA, 利用PCR技术进行目的基因扩增, 进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图1所示。FoxO1fl电泳结果(图1A)显示, 扩增产物在300和247 bp同时出现条带时, 该小鼠基因型为FoxO1fl/-; 扩增产物仅在300 bp出现条带时, 该小鼠基因型为FoxO1fl/fl。BGLAP-Cre电泳结果(图1B)显示, Cre+/-基因片段的扩增产物在300 bp出现条带, Cre-/-没有条带。基因型FoxO1fl/flCre+/-为条件性FoxO1敲除小鼠(纯合小鼠), 基因型FoxO1fl/flCre-/-为野生型小鼠(野生小鼠)。

图 1 小鼠FoxO1fl和BGLAP-Cre基因型鉴定
A:FoxO1fl; B:BGLAP-Cre。Ⅰ :Marker Ⅰ 。
Fig 1 Genotyping of FoxO1fl and BGLAP-Cre

随后, 进一步从mRNA水平和蛋白质水平验证是否成功敲除成骨细胞中的FoxO1。首先, 提取经基因型鉴定的纯合乳鼠和野生乳鼠的mRNA和蛋白质, 分别进行RT-PCR检测和Western blot检测, 如图2A所示, 纯合小鼠FoxO1 mRNA表达量较野生小鼠降低82%。纯合组成骨细胞中FoxO1蛋白质含量明显低于野生组(图2C)。此外, 分别提取了股骨、肝脏、肌肉、脂肪和胰腺组织mRNA进行RT-PCR检测, 结果如图2B显示, 纯合小鼠股骨中FoxO1表达量较野生组小鼠降低50%, 而在其他组织中, 纯合组和野生组小鼠FoxO1表达量的差异没有统计学意义。

图 2 mRNA和蛋白质水平验证成骨细胞条件性敲除FoxO1
A:成骨细胞FoxO1 mRNA; B:各组织FoxO1 mRNA; C:FoxO1蛋白质。* P< 0.05, * * * P< 0.001, 野生组与纯合组比较。
Fig 2 Verification of conditional FoxO1 knockout in osteoblasts from mRNA and protein level

2.2 表型分析

2.2.1 遗传性状 将F1代小鼠中基因型为FoxO1fl/-Cre+/-的小鼠与基因型为FoxO1fl/fl的小鼠繁殖后, 一共获得F2代小鼠108只, 其中雄鼠58只, 雌鼠50只, 雌雄的比例为116:100。在F2代小鼠中, FoxO1fl/flCre+/-小鼠24只(22.2%), FoxO1fl/flCre-/-小鼠28只(25.9%), FoxO1fl/-Cre+/-小鼠26只(24.1%), FoxO1fl/-Cre-/-小鼠30只(27.8%), 其比例基本符合孟德尔遗传定律, 说明成骨细胞特异性敲除FoxO1对小鼠繁殖没有影响。

2.2.2 生理指标及FoxO1对糖代谢的影响 以最后一次注射STZ开始计时, 分别在第0、1、2和4周时间点检测各组小鼠体重。如表2所示, 在第0和第1周时, 4组小鼠之间体重没有差异; 在第2和第4周时, 经糖尿病诱导的野生-糖尿病小鼠和纯合-糖尿病小鼠体重明显下降, 与野生和纯合小鼠的差异具有统计学意义。

表 2 不同组间小鼠体重变化g Tab 2 Weights of mouse in different groups during the experiment

此外, 分别在第0、1、2和4周取鼠尾静脉血进行空腹血糖检测。如表3所示, 与野生小鼠相比, 纯合小鼠空腹血糖值显著低于野生小鼠, 提示在机体正常条件性下, 成骨细胞条件性敲除FoxO1可调节小鼠糖代谢。在诱导糖尿病发生后, 野生-糖尿病小鼠和纯合-糖尿病小鼠血糖值明显高于野生小鼠和纯合小鼠, 并且在第1~4周, 纯合-糖尿病小鼠血糖值显著低于野生-糖尿病小鼠, 两者之间的差异具有统计学意义, 说明在糖尿病条件下, 成骨细胞条件性敲除FoxO1可在一定程度上改善高血糖状态。

表 3 不同组间小鼠血糖变化mg· dL-1 Tab 3 Glucose concentrations of different groups during experiment

为进一步探究FoxO1对小鼠糖代谢的影响, 在第4周进行了胰岛素耐受实验。实验结果以起始点的百分比表示, 如表4所示, 纯合组在第90和120 min时与野生小鼠的差异有统计学意义, 说明成骨细胞条件性敲除FoxO1可增加胰岛素敏感性。经糖尿病诱导后, 野生-糖尿病小鼠和纯合-糖尿病小鼠胰岛素敏感性明显降低, 在30~120 min与野生和纯合组出现的差异具有统计学意义。值得注意的是, 纯合-糖尿病与野生-糖尿病小鼠在60和90 min时出现的差异具有统计学意义, 说明在糖尿病环境下, 成骨细胞条件性敲除FoxO1可明显提高小鼠胰岛素敏感性。

表 4 胰岛素耐受实验结果% Tab 4 ITT in different groups during the experiment
3 讨论

一直以来, 糖尿病对于骨代谢的影响受到了极大的关注。糖尿病引起的氧化应激常常导致机体继发骨量减少、骨质疏松等骨代谢异常。在口腔方面, 糖尿病可引起牙周病变及牙槽骨丧失, 容易导致牙列缺损和缺失, 此外糖尿病可以影响种植体周骨改建, 降低种植体的成功率[12, 13]。随着对骨组织的深入研究, 研究者们发现除了胰岛β 细胞和肝细胞外, 骨组织对葡萄糖的代谢也起着重要的调控作用[14], 而FoxO1在糖尿病及其并发症的发生、发展过程中发挥着重要作用。成功建立糖尿病模型是研究FoxO1对糖代谢和骨代谢影响的基础, 本研究通过建立成骨细胞条件性FoxO1基因敲除小鼠模型, 并成功诱发糖尿病, 进行了初步的表型研究。

STZ是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲, 能通过葡萄糖转运蛋白(glucose transporter, GLUT)2进入细胞, 对胰岛β 细胞有选择性破坏作用, 能诱发许多动物发生糖尿病。本实验采用小剂量多次注射STZ同时配合饮用高糖水的方法建立糖尿病小鼠模型, 糖尿病模型建立的成功率达95%。

研究表明, 在胰腺组织中, FoxO1在胰岛β 细胞上呈现出专一性的高表达。FoxO1通过抑制β 细胞的增殖, 加重胰岛素抵抗的发生; 并且促进肝糖合成, 参与调节葡萄糖代谢, 从而诱导糖尿病的发生[15]。此外, 高糖环境会诱发氧化应激的发生, 刺激ROS的产生, 从而导致内皮细胞的损伤, 微小血管通透性的增加, 以及炎症因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α 、白细胞介素(interleukin, IL)-1β 和IL-6 等的释放, 激活FoxO1转录因子的活性; 而FoxO1转录因子又进一步刺激了炎症因子的表达, 形成一个循环放大环路, 最终引起机体胰岛素敏感性的降低和糖尿病并发症的发生。

本实验中, 成骨细胞条件性敲除FoxO1可降低小鼠空腹血糖值, 提示成骨细胞中FoxO1参与调节糖代谢。在分别将野生小鼠和纯合小鼠诱发糖尿病后, 纯合小鼠表现出明显的血糖调控作用, 其空腹血糖值显著低于野生小鼠, 这说明成骨细胞中FoxO1敲除可以改善糖尿病小鼠中的高糖血症。这可能是由于成骨细胞中敲除FoxO1后提高了小鼠的胰岛素分泌和胰岛素敏感性。总骨钙素(osteocalcin)可促进骨的发生、发育, 而未羧基化骨钙素可促进胰岛β 细胞增殖、胰岛素分泌以及提高胰岛素敏感性[16]。研究[17]发现, 通过敲除小鼠成骨细胞上的FoxO1和Ocn基因, 证实了FoxO1可直接与Ocn启动子结合, 从而抑制成骨细胞合成骨钙素, 并促进骨钙素的羧基化水平, 抑制未羧基化骨钙素的分泌, 从而导致胰岛素分泌降低、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受和肥胖的发

生。

糖尿病在口腔多种疾病的发生、发展中扮演着重要的角色, 糖尿病会增加牙周炎的发病风险及严重程度, 是牙周炎发生和发展的重要危险因素。此外, 糖尿病也是口腔种植的相对禁忌证, 高血糖可影响种植体骨结合, 影响种植体长期存留率, 同时未控制的高血糖也使种植体更易发生种植体周围炎。本实验成功建立了成骨细胞条件性敲除FoxO1小鼠糖尿病模型, 发现成骨细胞条件性敲除FoxO1降低小鼠血糖, 改善氧化应激状态, 这对于牙周炎及口腔种植具有深远的意义。

4 小结

经STZ小剂量连续多次注射并配合高糖饮水可成功诱导小鼠糖尿病模型。野生-糖尿病及纯合-糖尿病小鼠经糖尿病诱导后, 其体重较正常野生及纯合小鼠明显减轻。成骨细胞特异性FoxO1基因敲除参与调节糖代谢, 可改善糖尿病小鼠的高糖血症, 这可能是由于成骨细胞敲除FoxO1后提高了糖尿病小鼠的胰岛素分泌和胰岛素敏感性。

The authors have declared that no competing interests exist.

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