基质小泡及其与细胞骨架蛋白的关系
冼雪红, 蒋宏伟
中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院牙体牙髓病科; 广东省口腔医学重点实验室 广州 510055
[通信作者] 蒋宏伟,副教授,博士,Email:jianghw@163.com

[作者简介] 冼雪红,硕士,Email:xianxuehong@163.com

摘要

基质小泡作为与矿化密切相关的囊泡,在分泌和矿化过程中实现的多种功能与自身富含的相关蛋白质密不可分。本文就基质小泡及其提取和纯化、蛋白质组学,以及参与其分泌的细胞骨架蛋白等的研究进展进行综述,以便深入认识其相关蛋白质的作用机制,为临床促进矿化研究提供理论依据。

关键词: 基质小泡; 蛋白质组学; 矿化相关蛋白质; 骨架相关蛋白质
中图分类号:Q24    文献标志码:A      
Matrix vesicles and their relationship with cytoskeleton-associated proteins
Xian Xuehong, Jiang Hongwei
Guang- hua School of Stomatology, Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University; Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510055, China
Abstract

Matrix vesicles are small vesicles closely associated with mineralisation. During the formation and mineralisation of matrix vesicles, most functions are closely related to their own proteins. This article aims to review the research progress on matrix vesicles, their extraction and purification and proteomic and cytoskeleton-associated proteins related to secretion. Understanding the functions of related proteins and the underlying mechanisms contributes in providing theoretical basis for clinical research on mineralisation.

Keyword: matrix vesicles; proteomic analysis; mineralization-related protein; cytoskeleton-associated protein

基质小泡(matrix vesicle)作为矿物形成的原始位点, 早在20世纪60年代被发现于软骨组织中, 参与硬组织的矿化过程。2013年, 研究者通过扫描电子显微镜证实, 成牙本质细胞胞体及突起表面、髓周1/3牙本质小管中存在基质小泡, 且与内层牙本质矿化的发生与发展关系密切。基质小泡的分泌及其对硬组织形成的调控作用与其自身富含的多种蛋白质密不可分, 本文就基质小泡及其提取和纯化、蛋白质组学, 以及参与其分泌的细胞骨架蛋白的研究进展进行综述。

1 基质小泡

基质小泡是呈球形的、位于细胞外的、有膜包被的亚显微结构(30~300 nm), 起源于矿物形成细胞(成牙本质细胞、成骨细胞与软骨细胞等)的细胞膜, 通过出芽方式从细胞膜顶端微绒毛脱落进入细胞外基质, 选择性分布于牙本质、骨及软骨的初始矿化位点, 与牙本质、骨及软骨的矿化密切相关[1, 2]。有研究[3, 4, 5]报道, 在肌腱、血管平滑肌细胞、巨噬细胞等细胞中亦发现基质小泡, 参与肌腱炎、动脉粥样硬化斑块等的病理性钙化活动。目前, 对基质小泡的矿化机制较为认可的是:基质小泡尚未分泌至细胞外时, 能够吸收线粒体提供的Ca2+和PO43-, 生成无规则磷酸钙, 分泌至细胞外沉积于胶原纤维中; 然后继续吸收细胞外基质中的Ca2+, 与基质小泡内的PO43-反应生成成熟的羟磷灰石(hydroxyapatite, HA); 随着基质小泡内HA晶核的生长并向基质小泡膜迁移, 针状的HA晶体刺破基质小泡, 沉积于细胞外基质中启动矿化[6]。虽然牙本质、牙骨质、软骨、骨的矿物百分比, 胶原类型, 主要非胶原蛋白组成不同, 但其矿化机制基本一致, 均与生成HA从而启动矿化相关。

基质小泡和研究较为深入的外泌体(exoso-me)均是由细胞分泌的小囊泡体, 二者的区别在于:外泌体可由多种细胞分泌且为非黏附结构, 而基质小泡只能由矿物形成细胞分泌, 锚定于细胞外基质。研究者[1]根据基质小泡的大小、形态、脂质和蛋白质组成分析, 揭示其与外泌体可能为同源结构, 推测基质小泡可能参与细胞间信号转导以及调控硬组织的生长和发育。

1.1 基质小泡的提取与纯化

目前, 提取基质小泡的方法主要有两种, 分别为蛋白酶消化法和密度梯度离心法, 二者提取出的基质小泡在纯度、组成和功能等方面稍有差异。改良的蛋白酶消化法是目前基质小泡研究中应用较多的方法[7]

1.1.1 蛋白酶消化法 蛋白酶消化法是利用胶原酶或胰酶等消化组织块, 然后进一步用差速离心分离、纯化基质小泡。该法提取的基质小泡表现出均质性, 对基质小泡脂质成分、电解质和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的活性影响不大, 且启动矿化无需加入磷酸盐底物。然而该方法破坏了基质小泡内部分的蛋白质成分, 一般用于基质小泡脂质、电解质或者某些酶如组织非特异性碱性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline pho-sphatase, TNAP)等的研究。

由于基质小泡对蛋白酶和pH值高度敏感, 胰酶的浓度或溶液的pH值可影响其矿化能力, 所以胰酶的浓度一般控制在0.1%, 矿化培养基的pH值需控制在7.4~7.8。Balcerzak等[8]用改良的蛋白酶消化法成功地提取基质小泡并进行了蛋白质组学分析, 其通过改变酶的浓度、使用时间, 将细胞培养于体外矿化诱导液(synthetic cartilage lymph, SCL)中, 使基质小泡快速矿化。此种改良的蛋白酶消化法不但减少了传统蛋白酶消化法对蛋白质的破坏, 且不会影响基质小泡的矿化能力。

1.1.2 密度梯度离心法 密度梯度离心法为差速离心组织匀浆, 然后进一步用蔗糖密度梯度离心法或Percoll密度梯度离心法分离、纯化基质小泡。所提取的基质小泡接近于生理条件, 通常含有亚细胞膜碎片, 表现出不同的动力学特征, 适合于测定复杂系统内的矿化过程。然而由于蔗糖溶液的渗透压作用, 经由蔗糖梯度离心法提取的基质小泡, 磷酸盐溶解, 矿化程度较低, 需提供无机磷酸盐(inorganic phosphate, Pi), 如一磷酸腺苷(adenosine 5’ -monophosphate, AMP)以促进矿化[10]; 使用Percoll梯度离心法可将基质小泡分离、纯化为矿化诱导型和非矿化诱导型两种基质小泡, 但可能混入杂质Percoll。

1.1.3 其他提取方法 除以上两种方法, 尚有采用差速离心提取外泌体的方法提取基质小泡, 如体外培养生长板软骨细胞, 待其分泌基质小泡于培养基后, 进行差速离心。该方法可用于基质小泡的脂质组成和形成机制研究, 但此法提取的基质小泡与锚定于基质中的基质小泡在脂质组成和摄取矿物离子能力方面存在差异, 且无膜联蛋白和脂质依赖性的钙结合蛋白等。近年, 亦有研究者[9]尝试用Exo QuickTM试剂方法提取矿化和未矿化的人成骨肉瘤细胞Saos-2分泌的基质小泡, 提取以后经过形态学检查、标志抗原检测(CD63、CD9和Hsp70)检测、ALP活性分析以及体外形成HA的能力检测, 确定为基质小泡。

目前基质小泡缺少标志性蛋白质, 缺乏高效、可重复的分离及提纯方法, 矿物在样本制备过程中高度不稳定, 使后续研究存在一定困难。有学者[10]尝试采用等电点聚集或磁珠免疫捕获的方法进一步纯化基质小泡, 或使用凝胶过滤沉析法纯化前期牙本质中提取的基质小泡, 但每种方法均有各自的优点和缺点。基质小泡的质量对于实验结果的正确性和可重复性是至关重要的, 因此, 开发分离、纯化基质小泡的有效方法并分析其成分也是未来的研究方向。

1.2 基质小泡蛋白质

目前检测出2 700多种基质小泡相关蛋白质[11]。基质小泡与微绒毛有260多种共同蛋白质, 如TNAP、Na+/K+ 腺苷三磷酸酶(adenosine tri-phosphatase, ATPase)、膜联蛋白(annexin)、肌动蛋白(actin)和肌动蛋白调节蛋白等[12]

基质小泡的生物学功能取决于其蛋白质和脂质成分。目前基质小泡的研究聚焦于矿化相关蛋白质, 如Pi/无机焦磷酸盐(inorganic pyrophos-phate, PPi)相关蛋白质TNAP、核苷酸焦磷酸酶(nucleotide pyrophosphatase, NPP)1/磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PC)-1、磷酸酶(phospha-tase, PHOSPHO)1、磷酸盐转运体(phosphate inorganic transporter, Pit)1/2或钙离子相关蛋白质膜联蛋白等。已明确作用的蛋白质有:TNAP; PHOSPHO1; Na+/K+ ATPase; NPP1/PC-1; 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)- 2、 MMP-3、MMP-13; 膜联蛋白5; 转运蛋白(膜联蛋白1、2、4、6和7, Pit1、2); 整合素(β 1、β 5、α V、α 11、α 1、α 3)[13]。在这些蛋白质中, TNAP、PHOSPHO1在牙本质矿化中具有重要的作用。在对野生型小鼠的研究中发现, TNAP和PHOSPHO1共位于牙本质形成早期的成牙本质细胞中, 与罩牙本质矿化早期相符, 而且TNAP/PHOSPHO1缺乏可致牙本质矿化异常[14]。McKee等[14]对人成骨肉瘤细胞Saos-2分泌的基质小泡进行非标记定量蛋白质组学比较分析, 除了已确认基质小泡矿化相关蛋白质外, 还检测出无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase)-1, 碳酸氢钠协同转运蛋白(sodium bicarbonate cotransporter)4-A7和鞘磷脂磷酸二酯酶(sphingomyelin phospho-diesterase)-3等。其中碳酸氢钠协同转运蛋白4-A7调节基质小泡内pH, 而无机焦磷酸酶-1则主要调控细胞内外的 Pi/PPi平衡。鞘磷脂磷酸二酯酶-3是跨膜酶, 可通过催化鞘磷脂的水解, 生成神经酰氨和磷酸胆碱, 间接地增加磷酸盐水平而促进矿化; 还可调节基质小泡膜脂质组成和促进膜破裂而释放矿物, 其基因异常可致成骨不全。

近年来, 越来越多的基质小泡蛋白组学分析发现基质小泡不仅参与矿化, 还作为细胞间信号传导的介质, 参与细胞间信息的交流。Nahar等[15]通过分离软骨细胞基质小泡, 发现其含有信号蛋白和各种生长因子, 例如骨形态蛋白(bone mor-phogenetic protein, BMP)以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF), 提示基质小泡参与细胞间交流, 还可能与血管再生等有关。Morhayim等[16]通过分离矿化和非矿化的人成骨细胞基质小泡, 进行蛋白质组学分析, 发现基质小泡含有大量的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、烯醇酶α (alpha-enolase, ENO1)、程序性细胞死亡因子6结合蛋白(programmed cell death 6-interacting protein, PDCD6IP)、CD9等外泌体蛋白质, 且均高表达组蛋白; 将基质小泡作用于人前列腺癌细胞后, 发现基质小泡可能参与基因表达的调控, 为前列腺癌的疾病干预提供重要的理论基础。Deng等[17]发现成骨细胞分泌的基质小泡中含有核因子κ B受体活化因子配基(re-ceptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL), 其可与破骨细胞前体细胞膜上的核因子κ B受体活化因子(receptor activator of nuclear factor kappa B, RANK)结合, 激活RANKL-RANK信号通路, 从而促进破骨细胞形成。研究者[18, 19]分离乳牙牙髓干细胞中的外泌体, 发现外泌体抑制多巴胺能神经元凋亡, 同时可通过抑制组织蛋白酶B和MMP的活动参与炎症调节, 为帕金森病的治疗、抗炎机制的研究提供了思路。

2 细胞骨架蛋白

细胞骨架(cytoskeleton)指细胞内以蛋白质为主要成分的细丝, 起到支撑细胞形态、传导细胞内外信息的作用, 主要由微丝、微管和中间纤维丝组成。微丝又被称为肌动蛋白丝, 主要以单聚体球状肌动蛋白(globular actin)和多聚体丝状肌动蛋白(fibrous actin)两种形式存在。球状肌动蛋白可通过在丝状肌动蛋白刺端的组装和在尖端的去组装实现微丝的重组。微管可在延伸和收缩两种状态交换, 其动力学的不稳定性可实现微管骨架重组。基质小泡主要通过出芽方式从细胞膜脱落进入细胞外基质。基质小泡的释放、形态维持、在细胞外基质中的锚定伴随细胞骨架的重组。位于细胞骨架表面的细胞骨架蛋白直接或间接地参与细胞骨架的重组。

3 基质小泡与细胞骨架蛋白的关系

蛋白质组学分析研究[8, 20]证实, 基质小泡中存在众多细胞骨架蛋白, 参与基质小泡的出芽、脱落, 且调控过程中大多与肌动蛋白微丝的解聚有关, 如凝溶胶蛋白(gelsolin)、根蛋白(radi-xin)、丝束蛋白(plastin)、丙氨酸C激酶基质(myristoylatde alanine-rich C kinase substrate, MARCKS)、Rootlet、黏着斑蛋白(vinculin)、细丝蛋白(filamin)A、辅肌动蛋白(actinin)α 等。凝溶胶蛋白为调节和切割肌动蛋白的蛋白质, 当细胞内Ca2+浓度上升时, 可通过封端阻止肌动蛋白聚合, 切割肌动蛋白微丝, 从而刺激基质小泡的释放, 且切割有效率可达100%[21, 22]。根蛋白是适配蛋白和信号转导蛋白, 其C端与丝状肌动蛋白结合, 作为浆膜磷脂酰肌醇二磷酸(phospha-tidylinosital biphosphate, PIP2)与肌动蛋白之间的桥梁。T-丝束蛋白3有助于在基质小泡出芽时, 组装和维持细胞膜突出处的肌动蛋白骨架[23]。MARCKS是交联肌动蛋白丝和细胞膜的蛋白质, 通过蛋白激酶C磷酸化或结合钙调蛋白抑制其活动, 引起肌动蛋白细胞骨架重组[24]。Rootlet作为小根蛋白(rootletin)的聚合产物, 参与基质小泡的分泌和维持其形态。黏着斑蛋白与基质小泡形态维持、黏着、运动及信号转导等功能有关。细丝蛋白B通过交联肌动蛋白, 参与细胞膜与细胞骨架网络间的沟通[25]。辅肌动蛋白α -1、α -4与肌动蛋白的高亲和力有助于锚定肌原纤维肌动蛋白丝。在成骨细胞研究中, GPM6B作为关键的下调因子, 可能通过提供细胞骨架或细胞骨架相关蛋白的停靠位点, 参与肌动蛋白细胞骨架的再组装, 从而调节基质小泡的形成和矿化[26]

微管也参与基质小泡的形成和钙化。研究显示, 若分泌基质小泡的软骨细胞处于能量不足状态, 鸟嘌呤核苷酸趋于形成二磷酸鸟苷(guano-sine diphosphate, GDP), 刺激微管加速分解, 可促进基质小泡的形成。微管蛋白(tubulin)解聚也可刺激基质小泡的形成。Lee等[27]的研究显示, 微管在血管钙化中扮演重要的角色, 紫杉醇可稳定微管, 从而减弱血管平滑肌细胞基质小泡的释放。

4 结语

与外泌体为同源结构的基质小泡是成牙本质细胞、成骨细胞、成软骨细胞分泌细胞外基质的主要形式, 可参与细胞间交流, 影响癌细胞生存、侵袭和转移等生物学行为, 以及参与病理性

矿化[28, 29, 30], 如动脉粥样硬化、骨硬化或慢性炎症等。成牙本质细胞通过分泌具有矿化能力的基质小泡, 促使细胞外基质发生钙化, 在牙齿发育及修复性牙本质形成过程中, 尤其在矿化起始阶段起着重要作用。目前基质小泡的蛋白质组学分析大多集中于成骨细胞, 对成牙本质细胞分泌的基质小泡的蛋白组学尚未见报道。通过对成牙本质细胞及其基质小泡中细胞骨架作用的研究, 有助于加深对成牙本质细胞分化和牙本质形成分子机制的理解, 为牙髓损伤修复研究提供新的视角与思路, 并能为临床活髓保存治疗及促进矿化药物的研究、开发提供理论依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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