双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯细胞毒性的研究进展
陈秀春, 张志民, 洪丽华, 张雅琪, 郑鹏, 李文月
吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室; 吉林大学口腔医院牙体牙髓病科 长春 130021
[通信作者] 张志民,教授,博士,Email:zhangzm1964@sina.com

[作者简介] 陈秀春,硕士,Email:532537478@qq.com

摘要

细胞毒性是一种由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件,是化学物质作用于细胞基本结构和/或生理过程,如细胞膜或细胞骨架结构,细胞的新陈代谢过程,细胞组分或产物的合成、降解或释放,离子调控及细胞分裂等过程,导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱,从而引发的不良反应。双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯(TEGDMA)是牙科树脂材料中常用的稀释单体,也是树脂基质成分中引起细胞毒性的重要相关单体,可以引起细胞体内氧化平衡失调、细胞凋亡、DNA损伤等一系列毒性反应。本文就TEGDMA引起的细胞毒性研究进展进行综述,旨在为进一步明确其产生毒性的机制,减弱或消除其毒性作用奠定基础。

关键词: 双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯; 氧化应激; 细胞毒性; 基因毒性; 细胞凋亡
中图分类号:Q256    文献标志码:A      
Cytotoxic mechanism of triethylene glycol dimethacrylate
Chen Xiuchun, Zhang Zhimin, Hong Lihua, Zhang Yaqi, Zheng Peng, Li Wenyue
Key Laboratory for Tooth Development and Jaw Reconstruction and Regeneration of Jilin Province; Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Hospital of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021, China
Abstract

Cell toxicity is a pure cell killing event caused by a cell or chemical substances. The chemical substances act on the basic structure of the cell and/or physiological processes, such as cell membrane and cytoskeleton structure, cell metabolism, synthesis of cellular components or products, degradation or release, ion regulation and cell division. Which leads to adverse reactions such as cell survival, proliferation and/or functional disorder. Triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA) is a commonly used diluent of many resin-based dental composites. It is an important relevant monomer responsible for the cytotoxicity of the resin matrix. The monomer can lead to a series of toxic reactions, such as oxidative imbalance, apoptosis, DNA damage and so on. In this paper, the research advances in mechanism of cytotoxicity induced by TEGDMA monomer is reviewed, the aim is to lay the foundation for further clarifying the mechanism of toxicity and to reduce or eliminate the toxic effect.

Keyword: triethylene glycol dimethacrylate; oxidative stress; cytotoxicity; gene toxicity; apoptosis

双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯(triethylene glycol dimethacrylate, TEGDMA)是复合树脂基质常用的稀释剂成分, 也是常用牙本质粘接剂的组成成分, 占树脂基质成分的质量分数为25%~ 50%。TEGDMA在复合树脂中不仅具有稀释作用, 同时也参与聚合过程。在聚合过程中, 部分未完全聚合的单体会释放到液相环境中。由于具有亲脂性, TEGDMA分子容易进入哺乳动物的细胞质和细胞膜磷脂中[1], 进而参与细胞代谢, 产生细胞毒性。

1 TEGDMA单体引起细胞毒性的浓度和细胞类型

多位学者[2, 3, 4]针对TEGDMA在真核细胞中引起的毒性作用进行了大量研究, 实验所用TEGDMA的浓度为0.01~10 mmol· L-1, 其致实验细胞死亡的浓度因细胞类型不同而有所差别, 即使同一类型的原代细胞也会因供体不同而有所变化。用不同浓度的TEGDMA作用于不同种类细胞的研究表明, 300 μ mol· L-1以上的TEGDMA可对鼠巨噬细胞、V79中国仓鼠肺细胞、牙髓成纤维细胞产生细胞毒性, 影响细胞正常生长, 而100 μ mol· L-1时无明显影响[5, 6]。 Schweikl等[7]发现, TEGDMA可引起V79中国仓鼠肺细胞的微核数量增加和染色体断裂, 在TEGDMA浓度为0.75和1.00 mmol· L-1组微核数量增加为对照组(不含TEGDMA)的5~10倍, 在1.5和3.0 mmol· L-1组则因为毒性浓度过大引起细胞死亡而未见到微核形成。Schweikl等[8]的另一项研究表明, TEGDMA对于不同类型细胞所引起的基因毒性浓度也不相同, TEGDMA引起人皮肤成纤维细胞系G1期延长的浓度为0.5 mmol· L-1, 而对于人牙髓成纤维细胞则需3.0 mmol· L-1

TEGDMA引起细胞毒性的方式主要呈时间-浓度依赖性[9, 10]。Ginzkey等[11]用浓度低于已报道可引起细胞毒性浓度的TEGDMA, 观察其对人淋巴细胞的细胞毒性和基因毒性的影响, 结果显示, 仅在用实验中的最大浓度(100 μ mol· L-1)的TEGDMA时会引起轻微的细胞存活力下降, 在1、10和100 μ mol· L-1的TEGDMA组中均可观察到染色体畸变和姐妹染色体互换的增加, 且影响随浓度的增加而增大。Huang等[6]发现, 随着浓度的增加, TEGDMA对鼠巨噬细胞RAW264.7的毒性变大; 相同浓度的TEGDMA对细胞的毒性随培养时间的延长而增加, 且引起剂量依赖性微核数量增加和DNA条带断裂的基因毒性。Janke等[12]也报道了TEGDMA引起的牙龈成纤维细胞的细胞毒性, 以及凋亡随时间延长和浓度的增加而增强。

针对TEGDMA所引起的体外细胞毒性研究中, 所用细胞种类繁多, 以前大多采用已建株细胞系(如L929、3T3及癌细胞等), 而近年来的研究多采用原代细胞系(如牙髓组织纤维细胞和牙龈组织纤维细胞)。原代细胞系能较好地反映材料对人体细胞的影响。研究中所用TEGDMA浓度越接近材料在口腔中释放的浓度, 也就越能反映其毒性作用对口腔组织的影响情况。研究[11]表明, 将正畸用树脂粘接剂涂布于牙面, 在几分钟或几小时后, 可在唾液中检测到毫克级TEGDMA的渗出。细胞的选择和所用材料浸液浓度的确定对于模拟材料在口腔中的作用至关重要。现阶段有学者采用变形链球菌与牙髓成纤维细胞、唾液共同培养, 模拟了类似于口腔环境的情况, 来观察TEGDMA对于细胞的影响, 但目前针对树脂类材料在口腔内引起的相关反应研究相对较少, 仍需大量的病例调查及统计研究。

2 TEGDMA单体引起的细胞凋亡的机制

细胞凋亡信号转导通路有2条:外源性通路(死亡受体通路)和内源性通路(线粒体通路)。2条通路汇集于下游的死亡执行器效应子半胱天冬酶(caspase), 该效应子在细胞凋亡的执行阶段能够直接引起重要蛋白质的降解和核酸酶的激活, 最终导致细胞凋亡[9]

TEGDMA可引起多种细胞凋亡的发生。Ba-tarseh等[13]通过乳酸盐脱氢酶检测了0.25 mmol· L-1的TEGDMA对牙髓细胞促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白表达的影响, 发现TEGDMA可以同时活化内源性和外源性细胞凋亡通路。

2.1 表面死亡受体信号通路

细胞外的多种信号分子可与细胞表面的相应死亡受体相结合, 从而激活通路, 导致凋亡的发生。肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor rece-ptor, TNFR)家族即为一类死亡受体, 其中包括TNFR 1和2、Fas以及TRAIL-R 1-4等[13], 可与其相对应的配体肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α 、TNF-β 、Fas-L、TRAIL相结合。目前已知的死亡受体的凋亡诱导信号途径有3条:CD95/CD95L、TRAIL和TNFR信号转导通路。CD95与其三聚体配体的相关死亡结构域(Fas-associated death domain, FADD)结合, 再通过与半胱天冬酶8前体(Pro-caspase 8)结合最终形成Fas-FADD-Pro-caspase 8死亡诱导信号复合物, 启动凋亡。Iwama等[14]研究表明, TEGDMA可诱导U937细胞的TRAIL-R 1-4增加, Fas/Fas-L也有微量增加, 表明有细胞凋亡发生, 该结论符合Ba-tarseh等[13]的研究结果。

2.2 线粒体介导的凋亡信号通路

前凋亡蛋白Bid、Bad、Bax同属于细胞凋亡调节蛋白Bcl-2家族中起促凋亡作用的蛋白质, 可被半胱天冬酶8活化而启动内源性凋亡信号通

[15]。Gallorini等[16]将HGF细胞与唾液、变异链球菌共同培养, 研究TEGDMA的细胞毒性。当在HGF细胞中加入TEGDMA和唾液后, Bax的表达增加了1.3倍, 提示TEGDMA的加入可以使促凋亡蛋白的含量增加, 从而引起细胞凋亡; 在共培养环境中增加唾液量, 会使Bax的表达从3倍降低到1.6倍, 表明唾液的稀释作用会减小TEGDMA的致细胞凋亡作用。

Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等为同属于Bcl-2家族的具有抑制凋亡作用的蛋白质。当Bid被活化后, 可以导致Bcl-2家族中的Bad以及Bcl-w增加。用0.25 mmol· L-1的TEGDMA培养人牙髓细胞24 h后, 检测凋亡蛋白的表达, 可发现Bid增加, 也提示有内源性凋亡通路的活化[13]。研究[17]表明, 磷酸化的Bad可进入线粒体内, 并刺激线粒体内膜间的Cyto c、SMAC和HtrA等凋亡启动因子的释放, 同时Bad还可与抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-w结合, 从而抑制其抗凋亡作用。

以上研究表明, TEGDMA可同时活化内源性和外源性细胞凋亡通路, 引起细胞凋亡, 其致凋亡作用主要通过对多种促凋亡蛋白的活化以及减少抑制凋亡蛋白的表达而引起。细胞的死亡模式包括坏死和凋亡, 多位学者对于TEGDMA所引起的细胞死亡模式进行了探讨, 发现TEGDMA可同时引起凋亡细胞和坏死细胞的增加, 并由此推测TEGDMA可通过两种方式引起细胞死亡, 但对于TEGDMA引起细胞坏死的机制尚未明确, 仍需进一步的研究。

3 氧化应激在TEGDMA引起的毒性中的作用

TEGDMA可通过清除细胞内的抗氧化剂还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)而引起细胞内活性氧(reactive oxygen specie, ROS)的增加。虽然ROS的确切作用位点尚未明确, 但GSH在细胞质基质中合成并被运输到线粒体内, 因此抑制GSH的合成或者清除GSH都会引起线粒体内GSH减少[16]。线粒体内GSH的急剧减少会引起ROS增加, 造成氧化应激, 继而导致线粒体膜电位升高、酶失活、脂质过氧化、DNA变性断裂以及细胞凋亡, 最终导致细胞死亡[4, 18, 19]。8-羟基-脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanine, 8-OH-dG)是DNA经受氧化损伤的代表性产物, 可诱导基因的突变、碱基脱落和DNA链断裂。将人THP-1细胞暴露在3和5 mmol· L-1的TEGDMA中48 h后, 可以检测到很高的8-OH-dG水平, 提示有DNA氧化应激损伤的存在[20]

当细胞受到外界压力影响时, N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine, NAC)是GSH合成的前体, 并可直接作为体内ROS的抗氧化剂[21]。有研究[10]表明, 当有NAC存在时, TEGDMA引起的细胞毒性作用减轻, 这也证实了TEGDMA引起的细胞毒性与细胞内ROS的增加相关。NAC还与成骨细胞的矿化作用有关, 当TEGDMA作用于成骨细胞后会引起细胞的氧化应激反应, 此时参与矿化的NAC大部分被用于抵抗TEGDMA引起的细胞毒性反应, 以维持成骨细胞的正常存活和功能, 从而导致了成骨细胞的矿化过程受阻[22, 23]。NAC也可使因TEGDMA引起的成骨肉瘤MG63细胞的分化抑制现象得到恢复[24]

抗氧化剂(如NAC、维生素E、尿酸等)存在时, 均可减轻因TEGDMA引起的氧化应激而导致的细胞毒性作用, 提示在树脂基质成分中添加相应的抗氧化成分, 则可减轻因TEGDMA所致的细胞毒性作用。这可能会成为后续生物相容性更好的树脂材料稀释单体的一个研究方向。

4 TEGDMA引起的基因毒性

TEGDMA引起基因毒性的确切机制尚无定论, 目前认为主要有两方面原因[25, 26]:一方面, TEGDMA含有2个α , β -不饱和β 羰基, 可以通过迈克尔加成反应与DNA双链上的亲核位点结合, 导致链内脱氧核糖核酸的交叉链接; 另一方面, ROS是内源性DNA损伤的主要诱导剂, ROS可以与脂肪、蛋白质, 尤其是DNA的某些位点反应, 最终导致DNA链断裂、DNA点突变、DNA双链畸变和原癌基因与肿瘤抑制基因突变等形式的DNA损伤。

DNA损伤的表现通常为DNA降解。DNA降解是细胞凋亡后期的一个显著特点, 这种降解过程由一种内源性核酸内切酶在核小体连接部位切断染色体DNA导致, 在琼脂糖凝胶电泳中可呈现特异的梯状Ladder图谱。因此, 检测梯状DNA的形成可以作为细胞凋亡的标志[6]

细胞周期延迟是DNA损伤的另一种表现形式。细胞周期检测点是保证细胞周期中DNA复制和染色体质量的机制。DNA损伤可发生在细胞周期的任何时相, 所以DNA损伤检查点可分为G1期、M期和G2期检查点。当DNA损伤检查点被激活后, 会使细胞周期停滞或延缓, 然后通过碱基切除、核酸切除、重组和错配等方式修复受损DNA; 如损伤不能修复或不能正确完成, 则启动凋亡或非凋亡性死亡程序, 清除有损伤或病变倾向的细胞[27]。Eckhardt等[28]研究表明, 1 mmol· L-1的TEGDMA可导致85.3%的RAW264.7鼠巨噬细胞的G1期延长。当TEGDMA作用于牙髓细胞时也会引起G1期的延长[8]。另一项研究[6]表明, TEGDMA主要抑制RAW264.7细胞的细胞周期sub-G0/G1阶段。Eckhardt等[20]的另一项研究表明, 3~5 mmol· L-1的TEGDMA可使人髓系白血病单核细胞THP-1的G1期细胞增加2倍, 而G2期细胞增加5倍。同时, 还有其他研究表明, TEGDMA可使多种细胞的G2期受到抑制。造成这些研究结果不一致性的原因尚未明确, 可能与实验结果来自不同的实验室, 实验中所用TEGDMA浓度不同或者细胞来源不同有关。

肿瘤抑制蛋白P53是一种保护基因组的蛋白质, 可被G2期检查点激活。Mavrogonatou等[29]的研究表明, TEGDMA作用于HGF细胞后, 会上调P53的表达, 从而使细胞周期停滞, 启动修复程序; 若修复失败, 则会启动线粒体介导的凋亡信号通路, 导致凋亡的发生。相反, Durner等[30]用碱性解旋法研究10 mmol· L-1的TEGDMA对HGF细胞的基因毒性影响, 在1和24 h后都未发现DNA完整性的破坏。TEGDMA作为树脂材料释放的主要单体, 其引起基因毒性的信号通路仍存在多种说法, 其具体机制也应该成为以后研究工作中需要解决的问题。

5 总结与展望

TEGDMA作为现有树脂材料的稀释单体, 国内外学者对其安全性进行了大量研究, 尽管在体外研究中表现出不同程度的细胞毒性, 但尚未有临床研究表明其在人体引起明显不良反应, 且临床上因材料产生的不良反应而再次就诊的患者仍为少数。体外细胞实验中所用的TEGDMA浓度要远远高于其在口腔中释放的浓度, 体外研究实验不能完全代表树脂材料中释放的TEGDMA量, 且有研究[31]表明细胞内树脂单体的浓度为细胞外存在浓度的1/10, 释放到口腔中的分子还可被唾液稀释或者进入消化道, 或被代谢为环氧化合物。另外, 通过体外实验研究结果推测其在体内环境中的反应情况具有其局限性, 对于TEGDMA应用于口腔科治疗时, 其渗出到口腔环境中的程度尚未见有明确定量的文献报道, 且因TEGDMA所产生的体外细胞毒性机制尚不明确, 其引起体外细胞毒性与其引起临床不良反应之间是否存在关联, 仍需进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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