牙髓干细胞的表观遗传调控
张鑫, 汪成林, 杨静, 叶玲
口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科 成都 610041
[通信作者] 叶玲,教授,博士,Email:yeling@scu.edu.cn

[作者简介] 张鑫,硕士,Email:zhangxin0926@126.com

摘要

牙髓干细胞是牙髓组织中具有自我更新能力及多向分化潜能的一类成体干细胞,在牙髓修复、牙齿再生以及骨组织工程中发挥重要作用。表观遗传是指在DNA序列不改变的前提下基因表达发生了可遗传的变化,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等。研究发现,通过调控基因的转录过程,表观调控在牙髓干细胞的各项生物学行为中起着重要作用。本文对牙髓干细胞的表观遗传调控进行综述。

关键词: 表观遗传; 牙髓干细胞; DNA甲基化; 组蛋白修饰; 非编码RNA
中图分类号:Q756    文献标志码:A      
Epigenetic regulation in dental pulp stem cells
Zhang Xin, Wang Chenglin, Yang Jing, Ye Ling
State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract

Dental pulp stem cells (DPSCs) are adult stem cells with self-renewal ability and multiple differentiation potential. These cells play an important role in dental pulp repair, tooth regeneration, and bone tissue engineering. Epigenetics refers to heritable changes in gene expression without alteration of DNA sequence; these changes include DNA methylation, histone modification, and non-coding RNA regulation. Epigenetic modification plays an important role in regulation of DPSCs by influencing gene transcription. Thus, this study aims to elaborate epigenetic regulations of DPSCs.

Keyword: epigenetic; dental pulp stem cell; DNA methylation; histone modification; non-coding RNA

2000年, Gronthos等[1]首次从体外培养的牙髓组织中获得集落状生长的细胞, 该细胞可被诱导分化为成牙本质样细胞并形成牙本质样结构, 有较强增殖能力, 并具有形成细胞克隆的能力, 证实牙髓组织中存在干细胞群体, 由此提出了牙髓干细胞(dental pulp stem cell, DPSC)的概念。随后不久, Miura等[2]也从脱落乳牙的牙髓中分离出乳牙牙髓干细胞(stem cell from human exfolia-ted deciduous teeth, SHED)。在特定诱导条件下, DPSC可分化为不同种类的功能细胞, 如骨、软骨、肌肉、神经等细胞系, 同时作为牙髓中的成体干细胞, 能够促进牙髓组织再生及修复性牙本质形成[3]。目前, 虽然DPSC已被应用于多种组织工程及再生医学治疗研究, 但其调控机制依然存在很多盲点, 有待进一步深入研究和总结。

表观遗传学是20世纪80年代逐渐兴起的一门学科, 是研究非基因序列改变所致基因表达水平变化的一门遗传学分支学科[4]。常见的表观调控主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA介导的基因转录调控等, 在DPSC的干性维持、分化、凋亡、免疫调控以及组织再生等方面均起着重要的作用。深入了解表观调控DPSC的各种功能的机制具有非常重要的意义, 为干细胞生物治疗与组织修复再生工程提供理论基础。

1 DNA甲基化与去甲基化对DPSC的调控

DNA甲基化(DNA methylation)是重要的表观遗传修饰之一, 在大多数真核生物中广泛存在, 是在DNA甲基转移酶(DNA methyltrans-ferase, DNMT)的催化下, 以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)为甲基供体, 在胞嘧啶-磷硫酰-鸟嘌呤(cytosine-phosphorothioate-guanine, CpG)二核苷酸的胞嘧啶(cytosine, C)的5’ 碳原子上添加1个甲基基团, 形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)[5]。DNA甲基化主要发生在富含胞嘧啶和鸟嘌呤(guanine, G)的DNA序列的CpG岛(CpG island), 多位于基因启动子和第1外显子区。人类基因组中约有29 000个CpG岛, 通常呈非甲基化状态, 介导基因的表达, 而在DNMT的调控下, 催化原来未甲基化的CpG位点发生甲基化, 抑制基因表达[5]

干细胞的正常分化不仅需要通过DNA甲基化来沉默特定基因、抑制不和谐的分化表型的出现, 还需要DNA去甲基化来促进组织特异性基因的选择性表达, 以形成特定的细胞或组织特异性甲基化模式[6]。受体酪氨酸激酶样孤核受体(re-ceptor tyrosine kinase-like orphan receptor, ROR)可通过结合Wnt5a、CKle等生长因子调节经典和非经典Wnt信号通路的传导, 在骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell, BMSC)成骨向分化过程中, ROR2启动子区域发生去甲基化, 促进ROR2基因的表达, 进一步影响Wnt通路的信号转导, 参与BMSC成骨分化[7]。有研究[8]发现DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR可通过抑制DNMT的功能进而上调牙本质涎磷蛋白(dentin sialophospho-protein, DSPP)、牙本质基质蛋白(dentin matrix protein, DMP)以及成骨相关转录因子osterix(OSX)、Runt相关转录因子(runt-related trans-cription factor, RUNX)2的表达, 增加碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的活性, 促进牙髓细胞成骨向分化, 推测DNA甲基化在修复性牙本质形成过程中具有重要作用。而Nakatsuka等[9]研究发现, DNA甲基化在小鼠DPSC成肌向分化过程中具有重要作用, 通过5-Aza-CdR抑制DNMT能够促进DPSC骨骼肌向分化。TET作为DNA甲基氧化酶(DNA methyldioxygenase), 通过将5mC氧化参与DNA的去甲基化修饰[10]。Rao等[10]研究发现, 在通过短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)敲除小鼠牙髓细胞TET1后, 细胞增殖受到抑制, 并且在矿化诱导过程中, 小鼠牙髓细胞DSPP、DMP1的表达以及ALP活性、钙化结节形成受抑制, 提示TET1可能在牙髓修复及再生中具有重要作用。

除了单纯DNA甲基化调控基因表达外, DNA甲基化也可以与组蛋白修饰相互偶联, 从而产生复杂的表观遗传效应。研究[11]发现组蛋白甲基化转移酶EZH2能直接与DNMT作用, 使DNMT转移到Myt1启动子区域, 通过Myt1启动子甲基化来介导基因转录抑制。

最近一项对人不同种类干细胞的DNA甲基化模式进行的研究[12]发现, 相较胚胎干细胞及其他诱导性多能干细胞, DPSC作为神经嵴来源的干细胞, 其甲基化模式更接近于神经干细胞, 如表皮神经嵴干细胞(epidermal neural crest stem cell, EPI-NCSC)、人多巴胺能神经元前体细胞和胎盘组织, 并且认为DPSC可能成为研究神经系统疾病表观遗传机制的细胞模型。总体来说, 目前DNA甲基化修饰在DPSC中的研究还比较少, 其作用机制以及涉及的信号转导方面的认识还很有限, 有待进一步研究。

2 组蛋白修饰对DPSC的调控

组蛋白(histone)修饰包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)-核糖基化等, 使得组蛋白结构发生改变, 从而提供一种识别的位点, 被一系列特定的蛋白质所识别, 以实现对特定基因的调节。因此, 组蛋白修饰为其他蛋白质结合提供识别“ 语言” 标记, 即“ 组蛋白密码” (histone code)[13]。当发生组蛋白修饰时, 其结构发生改变, 影响基因的转录和表达。组蛋白甲基化、乙酰化是目前研究比较多的组蛋白修饰。

2.1 组蛋白甲基化对DPSC的调控

组蛋白甲基化是一种重要的表观调控, 是在组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase, HTA)的作用下, 将SAM上的甲基转移至赖氨酸或精氨酸位点, 使其发生甲基化[13]。组蛋白的甲基化通常发生在组蛋白H3或H4, 同一位点的组蛋白可以被单甲基化(me1)、双甲基化(me2)和三甲基化(me3)。甲基化形式的多样性, 极大地增加了组蛋白修饰调节基因表达的复杂性, 为发挥调控作用提供了更大的潜能。

干细胞分化过程的启动会诱导产生甲基化修饰酶, 引起特定基因甲基化水平的改变, 而不同位点的甲基化对基因的表达可以起到抑制或促进的作用。例如, 组蛋白H3K9、H3K27位点的三甲基化可介导特定基因转录的抑制, 而组蛋白H3K4或H3K36位点的三甲基化则会介导特定基因转录的激活[14]

EZH2与KDM6B作为组蛋白甲基化修饰酶, 分别介导H3K27的甲基化与去甲基化。Hui等[15]研究发现, 通过组蛋白甲基化抑制剂Dznep抑制牙髓细胞EZH2的表达后, H3K27me3表达水平下降, 骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)及OSX的表达上升, 促进牙髓细胞矿化分化。Xu等[16]则通过小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)作用敲除DPSC中KDM6B的表达, 发现OSX、骨钙素(osteocalcin, OCN)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)的表达受到抑制; 进一步研究发现KDM6B敲除可使骨形成蛋白(bone morphogenetic pro-tein, BMP)2启动子区域的H3K27me3增多, 导致BMP2表达下调, BMP2信号通路受阻, 抑制牙源性间充质干细胞的成牙/成骨向分化。有学者[17]KDM6B敲除后的DPSC与支架材料HA/TCP一起植入裸鼠皮下, 发现KDM6B敲除后DPSC形成矿化结节明显减少, 也提示KDM6B参与了DPSC成牙/成骨向分化的调控。

KDM2A作为组蛋白去甲基化酶, 通过介导H3K4或H3K36的去甲基化, 抑制BSPOPNOCN基因表达, 从而抑制DPSC的成骨和成牙本质向分化[18]。Du等[19]研究发现, KDM2A通过与BCL6共抑制因子结合而启动其去甲基化活性, 作用于上皮调节蛋白(epiregulin, EREG)基因的启动子, 使EREG启动子区H3K4及H3K36甲基化水平下降, 抑制EREG的表达, 进一步抑制牙源性间充质干细胞的成骨/成牙向分化。Dong等[20]研究发现, 通过shRNA干扰牙乳头干细胞KDM2A的表达后, 干性相关基因SOX2及NANOG启动子区域H3K4me3水平明显上升, 导致SOX2、NANOG基因表达增加, 并促进成脂和成软骨分化。

相关研究结果显示, 不同组蛋白甲基化修饰酶介导的组蛋白甲基化位点不同, 其效应也不同, 这增加了组蛋白甲基化对基因表达调控的复杂性, 尚需更多的研究阐释。

此外, 有研究[21]发现组蛋白的甲基化修饰还参与牙髓炎症反应过程。Hui等[15, 21]通过免疫组织化学及免疫荧光对牙髓组织中甲基化标记进行研究, 发现炎症牙髓组织EZH2及H3K27me3的表达明显下降, 而KDM6B表达上升; 体外研究显示, 在炎性因子牙龈卟啉单胞菌内毒素(Porphyro-monas gingivalis lipopolysaccharide)或重组人肿瘤坏死因子(recombinant human tumor necrosis factor, rhTNF)-α 刺激下, 牙髓细胞中EZH2表达明显下降; 而Dznep可以通过抑制EZH2的表达, 抑制牙髓炎症中白细胞介素(interleukin, IL)-1β 、IL-6、IL-8的mRNA水平。考虑到组蛋白甲基化是一种可以逆转的组蛋白表观遗传修饰, 阐明其对DPSC的调控机制使组蛋白甲基化抑制剂应用于临床调控炎症发展过程成为可能。

2.2 组蛋白乙酰化对DPSC的调控

组蛋白乙酰化主要是通过组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)和组蛋白去乙酰酶(histone deacetylase, HDAC)催化完成, 通常发生在赖氨酸上, 为可逆性生化反应。HAT能够通过催化组蛋白N-末端赖氨酸残基乙酰化, 带负电荷的乙酰基团可以中和组蛋白上的正电荷, 从而降低其与带负电荷的DNA之间的亲和作用, 使组蛋白与DNA的结合能力减弱, 核小体结构松弛, 进一步促进转录因子与DNA分子的接触, 激活特定基因的转录过程。反之, HDAC介导组蛋白发生去乙酰化时, 促使带正电的组蛋白与带负电的DNA紧密结合, 染色质呈致密结构, 抑制转录因子的结合, 导致基因转录阻遏[13]

HAT参与DPSC的成牙及成骨向分化的调控。譬如HAT-p300能作用于OCNDSPP启动子区, 致使其组蛋白H3K9发生乙酰化, 促进OCNDSPP基因的表达, 进一步促进牙髓细胞矿化分化[22, 23]。p300 shRNA转染牙髓细胞后, 可通过下调Cdc25A和上调p21waf1基因的表达, 致使细胞停滞于G0/G1期, 增殖能力明显下降, 诱发细胞凋亡[22]。同时, p300还作用于干性相关因子基因NANOGSOX2启动子区, 促进其表达, 维持细胞干性[23]

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacety-lase inhibitor, HDACi)能够通过抑制HDAC的活性, 提高组蛋白乙酰化水平, 从而调节基因的转录表达。Jin等[24]研究发现, HDACi曲古柳菌素A(trichostatin A, TSA)能够通过促进增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞周期相关蛋白CCDN1以及DSPP、DMP1、BSP的表达, 促进DPSC的增殖及矿化分化。进一步研究发现, JNK/c-Jun信号通路在TSA介导的DPSC增殖过程中发挥重要作用, Smad2和Smad3信号通路在TSA介导的DPSC矿化分化过程中发挥重要作用。通过尾静脉向孕鼠体内注射TSA, 待小鼠出生后取样发现, 给予TSA刺激的小鼠牙本质基质较对照组明显增加(1.64倍), 且成牙本质细胞数也增加(1.74倍), 提示组蛋白乙酰化在小鼠牙齿发育中具有重要作用[24]

除TSA之外, 其他的HDACi如丙戊酸(val-proic acid, VAP)、辛二酰苯胺异羟肟酸(sube-roylanilide hydroxamic acid, SAHA), 同样可以调控DPSC增殖及矿化分化[24, 25, 26, 27, 28]。研究[27]发现, 低浓度VPA(< 2 mol· L-1)对DPSC细胞周期及增殖无明显影响, 而高浓度VPA(5 mol· L-1)却可以抑制DPSC的增殖, 促进细胞凋亡; VPA可以促进早期矿化相关因子ALP、BSP及OPN的表达, 抑制晚期矿化相关因子OCN的表达。目前, HDACi成为药物研究的新热点, 其对DPSC的调控已引起注意, 有望应用于牙髓修复再生领域[29]

3 非编码RNA对DPSC的调控

非编码RNA(non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA, 由于缺乏开放阅读框, 常由编码蛋白质的基因反转录而来, 包括核糖体RNA(ribosomal RNA, rRNA)、转移RNA(transfer RNA, tRNA)、核小RNA(small nuclear RNA, snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)和微RNA(micro RNA, miRNA)等[30]。其共同点是能从基因组上转录而来, 但是不翻译成蛋白质, 在RNA水平上行使各自的生物学功能。其中, miRNA在表观遗传领域中研究较多。miRNA是在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码单链RNA, 链长20~23个核苷酸。miRNA可与mRNA的3’ -非翻译区(untranslated region, UTR)结合, 导致目标mRNA的转录降解或翻译后抑制, 达到调控转录后的表达[30]。近50%的转录后调控均有miRNA参与, 调节细胞生长、组织分化, 并且与疾病发生有关。

DPSC在矿化分化过程中, 伴随着miRNA表达水平而变化。有学者[31]通过基因芯片对DPSC中miRNA的表达水平进行研究, 发现DPSC向成牙本质细胞分化过程中has-miR-633、has-miR-559、has-miR-122水平显著上升, 而has-miR-210、has-miR-1246、has-miR-31水平显著下调, 其中has-miR-633和has-miR-10可能与DPSC矿化分化有关, 但具体作用机制有待进一步研究[31]。DSPP、DMP作为成牙分化特异性蛋白质, 在牙齿发育及矿化中具有重要作用。一些研究[32, 33]发现, Let-7 miRNA 家族可以作用于DMP1的3’ -UTR, 介导DMP1的转录后表达, 而miR-885-5p、miR-586以及miR-32可以介导DSPP的转录后表达。除了直接调控外, 还有研究[34]发现miR-145可以作用于转录因子Klf4及OSX的3’ -UTR, 抑制基因的表达, 而Klf4的抑制又进一步导致DSPP及DMP1的抑制, 从而调控牙髓间充质细胞的成牙向分化。RUNX2作为转录因子能够介导干细胞的成骨/成牙向分化, miR-218通过作用于RUNX2基因的3’ -UTR调控基因表达。在DPSC矿化、分化过程中, 可以发现hasmiR-218的表达下降, 进一步促进RUNX2的表达[35]。miR-135b通过与Smad4、Smad5作用, 抑制基因的表达, 而Smad作为BMP信号通路中的重要转录因子, 在牙髓细胞成牙/成骨向分化中具有重要作用[36]。miR-720可以通过作用干细胞标记物NANOG的基因的3’ -UTR, 参与牙髓细胞的干性维持, 促进牙髓细胞矿化分化, 并且能通过抑制Ki-67的表达, 抑制牙髓细胞的增殖[37]

此外, 研究发现miRNA在干细胞炎症免疫、衰老等过程中具有重要作用。Zhong等[38]发现炎症牙髓中miR-150、miR-584、miR-766A表达明显上升, 同时有33个miRNA的表达明显下降, 其中miR-152、miR-148以及miR-181已被证实在免疫反应中具有重要作用。转录因子Oct4B1在牙髓炎症反应中具有重要作用, Kong等[39]研究发现通过siRNA敲除牙髓细胞中的Oct4B1, 多个miRNA的表达发生变化, 其中miRNA221在MPAK、Wnt以及Toll样受体信号通路中具有重要作用, 提示其可能参与Oct4B1介导的牙髓炎症反应。miR-146a能够通过调控白介素受体相关激酶1和肿瘤坏死因子受体相关因子6的表达, 促进牙髓细胞迁移[40]。miR-152可以通过作用于SIRT7的3’ -UTR, 抑制基因的表达, 参与DPSC衰老过程的调控[41]。目前只有小部分miRNA生物学功能得到阐明, 其对DPSC的各项生物学行为的调控有待进一步研究。

4 小结与展望

DPSC作为成体干细胞, 在牙髓修复和牙齿再生以及骨组织工程中具有重要作用。表观调控能够不依赖DNA序列改变调控基因表达, 在干细胞功能中发挥作用, 已受到广泛关注。DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA等构成了一个宏大的表观遗传调控网络, 其相互作用共同调控干细胞的生命活动。表观遗传调控在DPSC的研究还处于早期阶段, 有待进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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