RNA腺嘌呤6-甲基化修饰调控干细胞分化的研究进展
武云舒, 袁泉
口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院种植科 成都 610041
[通信作者] 袁泉,教授,博士,Email:yuanquan@scu.edu.cn

[作者简介] 武云舒,硕士,Email:sophiawu0624@163.com

摘要

腺嘌呤甲基化形成6-甲基腺嘌呤(m6A)是真核生物中最为常见的一种RNA转录后修饰,参与众多基因的表达及细胞活动中复杂而精细的生物学调控。腺嘌呤的6-甲基化是一种动态可逆性过程,甲基转移酶Mettl3、Mettl14和Wtap催化m6A的生成,而去甲基化酶FTO和ALKBH5可以催化m6A去除甲基。近年来的研究发现,甲基转移酶和去甲基化酶可以通过在RNA上“书写”或“擦除”m6A标记来调控干细胞的多能性和分化,为RNA表观遗传学调控干细胞命运提供了新的研究角度。

关键词: 6-甲基腺嘌呤; 甲基转移酶; 去甲基化酶; 干细胞分化; 多能性
中图分类号:Q753    文献标志码:A      
Regulation of RNA N6-methylation of adenosine on stem cell differentiation
Wu Yunshu, Yuan Quan
State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Dept. of Implantology, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract

N6-methylation of adenosine is the most prevalent post-transcriptional RNA modification in eukaryotes. Mettl3, Mettl14 and Wtap are methyltransferases that catalyse the formation of N6-methyladenosine (m6A). Demethylase, FTO and ALKBH5 can remove the methyl of m6A, thereby rendering a dynamic and reversible m6A modification. Methyltransferases and demethylases can regulate the pluripotency and differentiation of stem cells through writing and erasure of m6A marks on RNA. These data provide a novel dimension in epigenetic regulation at the RNA level to affect stem cell fate.

Keyword: N6-methyladenosine; methyltransferase; demethylase; stem cell differentiation; pluripotency

6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)指腺嘌呤第6位N原子上甲基化后形成的化合物, 其在多种真核生物中具有高度保守性[1]。同时, 腺嘌呤6-甲基化修饰是真核细胞生物中信使RNA(messenger RNA, mRNA)和长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)上最为常见的一种RNA转录后修饰。

m6A拥有重要的生物调控功能, 在mRNA的剪接、稳定性、出核转运和RNA与蛋白质相互作用等方面以及诸多基因表达和细胞生命活动中起着举足轻重的作用[2, 3, 4, 5, 6, 7]。甲基转移酶和去甲基化酶的相继发现确立了m6A修饰的动态可逆性, 更增添了其在多种生物通路中调控的复杂性和精确性。

近几年的研究揭示, 甲基转移酶和去甲基化酶可以通过对细胞中m6A水平的调节, 影响哺乳动物干细胞的多能性和分化, 为RNA表观遗传学调控干细胞命运提供了新的研究角度。

1 甲基转移酶对干细胞分化的调控作用
1.1 Mettl3-Mettl14复合体

20世纪90年代在体外HeLa细胞核提取物中分离纯化得到了一个包含S-腺苷甲硫氨酸结合位点的70 kDa的甲基转移酶复合物亚基, 即Mettl3, 并在很多人体组织中检测到了Mettl3的表达。2014年, 学者[8, 9]在研究中发现了和Mettl3有着部分同源性的Mettl14。Mettl3和Mettl14形成稳定的异源二聚体, 即Mettl3-Mettl14复合体, 并在催化腺嘌呤甲基化修饰形成m6A中发挥协同作用。Mettl3与细胞生命活动及生长发育息息相关, mettl3的沉默会引起细胞凋亡[2], 而敲除酵母和植物中编码Mettl3同系物的基因则会导致不同程度的发育停滞[10, 11]

近年来的研究[9, 12, 13, 14]发现, 小鼠及人类的胚胎干细胞中大量转录本均存在腺嘌呤6-甲基化修饰, 其中决定细胞状态及命运的众多核心调控因子广泛存在腺嘌呤6-甲基化修饰, 充分显现了m6A对胚胎干细胞的多能性及分化的重要影响。Mettl3作为甲基转移酶复合体Mettl3-Mettl14中的关键成员, 通过对目标mRNA相应靶点腺嘌呤6-甲基化修饰, 在胚胎干细胞的发育过程中发挥着举足轻重的作用。

早前Wang等[9]研究发现, 敲除mettl3后的小鼠胚胎干细胞丧失了自我更新能力, 指出m6A起到降低发育相关因子mRNA稳定性的作用, 从而有助于胚胎干细胞基态的维持。然而, 后续研究[12, 13, 15]表明, 小鼠胚胎干细胞中因mettl3缺陷所带来的m6A水平低下会导致严重的分化障碍、基因调控与表达的失衡, 甚至胚胎的早期死亡。在小鼠胚胎干细胞中大量的核心多能性因子的mRNA上都检测到了Mettl3的作用靶点, 这些多能性因子本应随着胚胎干细胞的成熟和分化而逐渐下调, 但是mettl3的敲除使得多能性因子的适时表达下调受到抑制, 进一步致使谱系分化相关因子的mRNA不能及时上调和表达, 从而严重影响了小鼠胚胎干细胞的分化和谱系形成, 使得胚胎干细胞在分子生物学和组织学水平上都停滞于一种原始而幼稚的状态。Batista等[12]首次在体外以人类胚胎干细胞为研究对象, 表明Mettl3为人类胚胎干细胞向内胚层及神经系统分化所必需。Aguilo等[13]在对染色质相关的锌脂蛋白(chromatin-associated zinc finger protein, ZFP)217的实验中发现, ZFP217可抑制Mettl3与目标mRNA上作用靶点的结合。小鼠胚胎干细胞在敲除Zfp217后, ZFP217对Mettl3的拮抗作用减弱, m6A水平上调, 从结果上促进了干细胞的分化, 进而正向印证了Mettl3对胚胎干细胞分化的影响。

值得一提的是, Mettl3对胚胎干细胞的调控效应还与干细胞的多能性状态及成熟阶段有一定关联。处在不同发育阶段的胚胎干细胞, 其细胞内不同基因的表达基础各异。处于幼稚期的胚胎干细胞内, 多能性基因表达居多; 在较为成熟的外胚层干细胞内, 编码谱系分化相关因子基因的表达更占优势[15]。敲除mettl3后的“ 放大” 效应使细胞内在该时期有着表达优势的基因得以进一步上调, 从而加重了细胞内原有的不同基因之间表达的不平衡性。因此, 对幼稚期的胚胎干细胞和外胚层干细胞分别进行mettl3敲除后, 这两种细胞分别向两个极端发展, 前者停滞于一种“ 超” 幼稚多能性状态而止步不前, 后者加速了细胞分化, 最终走向死亡。这一结果充分体现了Mettl3在调节胚胎干细胞各个阶段的成熟和分化中的精准性、复杂性和时效性, Mettl3对干细胞分化节律的掌控决定着干细胞的命运。

为验证体外实验所展现出的表型与体内实际发育状态的吻合度, Geula等[15]对敲除mettl3的小鼠胚胎进行了体内的追踪研究, 发现敲除mettl3具有胚胎致死性, 所有敲除mettl3的纯合子幼崽均在出生前死亡。敲除mettl3的胚胎在胎龄5.5~7.5 d开始出现畸形, 这期间幼稚多能性因子表达水平居高不下及编码谱系分化相关因子的上调失败现象均与体外实验极为相似。

Mettl3参与催化的mRNA腺嘌呤6-甲基化修饰像“ 分子开关” 一般在小鼠胚胎干细胞分化中起着重要的调节作用, 它确保了多能性因子下调的可靠性和及时性, 进而为胚胎干细胞的适时谱系成熟及细胞分化提供了有力的保障。Geula等[15]的实验从不同角度、多个方面为Mettl3在胚胎干细胞分化中扮演重要角色这一发现提供了有力的佐证。同时, 该实验还建立了敲除mettl14的小鼠胚胎及胚胎干细胞, 其表型与相应敲除mettl3后的结果如出一辙, 因而表明Mettl14对干细胞的调控作用也同样不可小觑。

1.2 Wtap

Wtap是继Mettl3-Mettl14复合体之后被发现的催化腺嘌呤6-甲基化的甲基转移酶复合物的第3种组成成员。Wtap自身虽不具有甲基转移酶活性, 但其对Mettl3-Mettl14复合体在核散斑上的定位具有辅助作用, 是Mettl3-Mettl14复合体正常行使催化功能的重要前提[8, 16]

Ping等[16]以斑马鱼胚胎为模型, 在组织学水平上对Wtap和Mettl3的功能进行探究, 首次提出催化m6A形成的甲基转移酶为正常组织分化所必需, 而Mettl3与Wtap是确保该类酶行使酶活性的重要组成部分。Wtap和Mettl3参与早期的胚胎发育, 敲除wtap的胚胎出现多处发育缺陷, 表现为小头、小眼、小脑室、脊索弯曲等, 其畸形程度远重于敲除mettl3的胚胎, 提示Wtap在调控干细胞分化方面似乎有着更大的潜能。其实, 在此之前, Fukusumi等[17]通过诱导wtap突变小鼠, 发现Wtap缺陷具有胚胎致死性。实验中内胚层和中胚层决定性标志因子Foxa2及Brachyury的阴性检测结果表明, Wtap在小鼠胚胎干细胞分化中起着至关重要的作用, 但对其中的具体机制并未进行深入的探究。

2 m6A去甲基化酶对干细胞分化的调控作用
2.1 fto基因

众多研究[18, 19, 20, 21]表明, fto基因与肥胖症、心血管疾病、Ⅱ 型糖尿病、阿尔茨海默病等疾病的发生、发展密切相关。Jia等[22]最早发现Fto可以擦去RNA上的m6A标记, 标志着m6A动态可逆性修饰的确立。

早期的研究[23]中观察到敲除fto的小鼠体重明显减轻, 提示Fto可能与脂肪沉积息息相关, 而Fto去甲基化酶活性的发现为探究Fto影响脂肪代谢的机制提供了新的线索。Zhao等[24]的研究发现, Fto依赖性m6A去甲基化修饰可以调控脂肪前体细胞的分化, 并在脂肪形成中不可或缺。实验中Fto的耗竭提高了成脂相关转录因子mRNA的m6A水平, 进而促进了丝氨酸/精氨酸富集的剪接因子2与其在成脂相关转录因子mRNA上靶点的结合, 改变了该因子两种异构体的表达比例, 导致有利于脂肪前体细胞分化的异构体数量显著降低, 最终表现为脂肪前体细胞严重的分化障碍。近期研究[25]表明, Fto的去甲基化酶活性对脂肪前体细胞分化的影响与过氧化物酶体增殖物激活受体-γ 有关, 后者可激活众多成脂相关基因的转录。

2.2 ALKBH5

ALKBH5与Fto同属于烷基化DNA修复蛋白B亚族[26], 其去甲基化酶活性也与Fto相当[3]。ALKBH5主要存在于核散斑中并可影响mRNA的出核转运。ALKBH5在睾丸组织中表达水平最高, alkbh5缺陷会致精子形成异常, 引起小鼠不育[3]

3 展望

腺嘌呤6-甲基转移酶和m6A去甲基化酶对干细胞多能性和分化的影响极大地拓展了对m6A在基因表达和生物调控功能上的认知, 更增强了m6A在临床方面的应用前景。然而, 目前相关研究尚不足, 同时还需要更多的体内实验证据来支持和完善现阶段的实验数据及结论。现有实验的大部分焦点都落在了从胚胎及胚胎干细胞水平上腺嘌呤6-甲基转移酶对干细胞分化的影响, 在今后的实验中, 不妨将目光转移至更广泛的成体干细胞, 建立组织特异性敲除mettl3的小鼠模型, 以探求腺嘌呤6-甲基转移酶在胚胎发育阶段过后对机体细胞生命活动的调控特点, 不断丰富对m6A生物功能的了解。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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