牙源性干细胞的特点及其在骨组织工程中的应用
周洁, 王颖, 张雷, 吴婷婷, 周咏, 邹多宏
安徽医科大学口腔医学院 安徽医科大学附属口腔医院种植科 安徽省口腔疾病研究省级重点实验室 合肥 230032
[通信作者] 邹多宏,副教授,博士,Email:zouduohongyy@163.com

[作者简介] 周洁,硕士,Email:15856950201@163.com

摘要

近年来,口腔特有的成体干细胞,包括牙髓干细胞、脱落乳牙干细胞、根尖乳头干细胞、牙周膜干细胞、牙囊前体干细胞等作为种子细胞为组织再生研究提供重要的细胞来源。现就这些牙源性干细胞的特点以及其在骨组织工程中的应用研究进行综述。

关键词: 成体干细胞; 种子细胞; 牙源性干细胞; 骨组织工程
中图分类号:Q813.1    文献标志码:A      
Characteristics of dental tissue-derived stem cells and their application in bone tissue engineering
Zhou Jie, Wang Ying, Zhang Lei, Wu Tingting, Zhou Yong, Zou Duohong
College of Stomatology, Anhui Medical University, Dept. of Implantology, Affiliated Stomatological Hospital, Anhui Medical University, Key Laboratory of Oral Diseases Research in Anhui Province, Hefei 230032, China
Abstract

In recent years, adult stem cells obtained from dental tissue, including dental pulp stem cells, stem cells from human exfoliated deciduous teeth, apical papilla stem cells, periodontal ligament stem cells and follicle progenitor cells, provide sources of seed cells for oral tissue engineering in dentistry. In this paper, we review the characteristics of these adult stem cells and their applications in bone tissue engineering.

Keyword: adult stem cell; seed cell; dental tissue-derived stem cell; bone tissue engineering

干细胞是一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞, 能够形成一个或多个特殊细胞类型。干细胞所居住的场所也就是干细胞在体内的局部微环境, 由相邻细胞、黏附分子及基质等组成。这种微环境结构起着平衡干细胞自我更新和分化的功能, 适当调节这种平衡有助于组织修复和维持内环境的稳态。研究[1, 2]表明, 各种各样的组织和器官内干细胞的调控是由巢的细胞外基质和干细胞内的遗传程序共同完成。在适宜的培养条件下, 干细胞可以增殖并被诱导分化成骨、软骨、肌肉、脂肪、神经等组织细胞, 可成为组织工程良好的种子细胞。

根据发育阶段, 干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的分化和增殖构成个体发育的基础, 而成体干细胞的进一步分化则是成体组织和器官修复、再生的基础。

组织工程所用细胞的最佳来源为自体成体干细胞。口腔组织包含多种成体干细胞, 其中来源较为广泛的是牙源性干细胞, 如牙髓干细胞(den- tal pulp stem cell, DPSC)[3]、脱落乳牙干细胞 (stem cell from human exfoliated deciduous teeth, SHED)[4]、根尖乳头干细胞(apical papilla stem cell, SCAP)[5]、牙周膜干细胞(periodontal liga-ment stem cell, PDLSC)[6]、牙囊前体细胞(den-tal follicle progenitor cell, DFPC)[7]。在特定培养条件下, 这些牙源性干细胞与人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)的特征难以区分, 因为它们可以表达hESC的诸多特定物质, 如SSE-4、TRA-1-60、TRA-1-80、TRA-2-49、Nanog、Oct4、Sox2等。这些牙源性干细胞甚至可以在体内产生畸胎瘤, 在体外形成包含所有三胚层组织的胚状体[8]。随着牙源性间充质干细胞的分离、获得以及相关研究的深入, 发现其不但具有自我再生能力和多向分化潜能, 而且免疫原性低, 故被认为是组织再生的种子细胞之一。以下对目前可应用于组织工程的牙源性成体干细胞进行分述。

1 牙髓干细胞

Gronthos等[3]的研究表明, 一种牙髓来源的细胞在体内表现出与骨髓干细胞相似的再生牙髓-牙本质复合体的能力, 因此称之为DPSC。DPSC是从人类牙组织分离的第一种牙齿干细胞。目前, 通过酶消化法已成功地将DPSC进行分离和培养, 并通过极限稀释法进行纯化[9]

DPSC具有干细胞的性质, 例如自我更新能力和多谱系分化能力。目前, DPSC的多谱系分化能力主要表现在能成功分化为成牙本质细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元以及肌肉细胞。

研究者[10]将DPSC和PDLSC共培养时, 发现两种细胞的增殖、牙本质涎蛋白(dentin sialopro-tein, DSP)和骨桥蛋白(osteopontin, OPN)的表达都有所增加, 而共培养中仅DPSC表达牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)mRNA, 单一培养中则无DSPP mRNA表达, 据此推测共培养通过缩短时间表达特异性基因的方法来影响mRNA的表达。因此, 可以通过将两种细胞共培养, 促使DPSC表达DSPP, 从而可以促进牙体组织的生长和矿化等。这对于在组织工程中使用PDLSC诱导DPSC分化有一定指导意义, 从而进一步证实了DPSC具有多谱系分化的能力。

也有文献[11]报道DPSC能够在体内分化为成骨细胞并产生骨样组织。然而, 在Annibali等[12]的研究中, 使用人DPSC在裸鼠模型中未能形成新骨。Zhang等[13]发现, 在鼠骨形成研究中, 并没有鼠DPSC形成新骨的证据。Laino等[14]成功在体外使用DPSC形成新鲜自体骨, 将新鲜自体骨植入鼠皮下4周后, 其成功改建为板层骨。同时, DPSC还可与壳聚糖等支架材料复合, 在体内外成骨[15, 16], DPSC与生物材料复后在未来骨组织工程的应用中具有极大潜力[16], 但其对DPSC向成骨细胞分化机制的影响仍有待于进一步的研究。由于DPSC具有更高的增殖率和更好的骨向分化能力, 而骨髓间充质干细胞分化成骨细胞速率有限且产生钙化结节较小, 所以DPSC是骨形成研究中除了骨髓间充质干细胞之外的最佳理想细胞。但是, DPSC的体外成骨具有一定限制性, 选择合适的支架材料, 保证其能够形成一个完整组织的细胞型而不是单纯包绕矿化基质的单层细胞是目前DPSC体外成骨成功与否的重要因素。

2 脱落乳牙干细胞

2003年, Miura等[4]首先从脱落乳牙的牙髓组织中发现并分离出具有高分化潜能的单克隆干细胞SHED。这是首次从人类自然可替换的器官乳牙获得干细胞, 成为独特干细胞来源。SHED与血液中干细胞相似, 具有分化成牙本质细胞、脂肪细胞、神经元、骨感应细胞的能力, 有望在自体干细胞移植、牙组织工程及临床中应用。

在体外, SHED显示出了比骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cell, BMSSC)更高的增殖率、克隆形成率和倍增率, STRO-1和CDl46(MUCl8)表达阳性, 也主要分布在微血管周围, 具有分化为神经元、脂肪细胞和成牙本质细胞的特性, 表达间充质和血管相关的标记。

此外, SHED经得起低温贮存, 能在液氮长时间保存, 使其可以成为干细胞库的一部分[17]。近期的研究[18]表明, 在狗下颌骨缺损模型中, 冻存5年的SHED仍然有增殖能力, 且在成骨过程中无任何免疫反应。另有研究[4, 19]发现, SHED在植入免疫缺陷动物后, 能在老鼠脑组织中生存和迁移, 并且能够在体内产生非板层骨和牙本质样结构。

SHED在骨组织工程的应用在近年来有很大的发展。SHED在壳聚糖/转化生长因子(transfor-ming growth factor, TGF)-β 1支架/因子复合材料上可以增殖并且可以分化为成骨细胞, 这对将来在骨组织工程使用SHED/壳聚糖/ TGF-β 1支架具有重大的意义[20]。在小鼠下颌骨缺损模型中, 研究者[21]使用三维聚乳酸羟基乙酸支架复合SHED材料植入受损区, 1个月后处死动物取标本, 发现其对小鼠无任何不良反应, 且在实验期间内SHED的成骨潜能可以一直维持。提示SHED复合三维聚乳酸羟基乙酸支架可作为骨缺损的一种新型替代物。

3 根尖乳头根干细胞

SCAP是一种新兴的多能干细胞群体[5]。SCAP来自于发育中的组织, 可以通过根尖组织的组织块培养法或者酶消化法获得。作为一种新发现的后天干细胞群, SCAP通过与多种成骨或成牙本质标志物共表达STRO-1表现出异构性, 在SCAP与其他成骨或成牙本质细胞共培养中发现, STRO-1阳性细胞百分比低, 而在单独培养的成骨或成牙本质细胞中STRO-1阳性细胞百分比高。另外, 通过免疫组织化学染色, SHED在几种神经标志物染色中呈阳性, 例如β Ⅲ 微管蛋白、神经元核心抗原(neuronal nuclei, NeuN)、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经微丝蛋白M和神经元特异性烯醇化酶(neu-ronspecific enolase, NSE)。这就是说, SCAP与DPSC和SHED相似, 可能来源于神经嵴细胞, 或者来源于神经嵴相关的细胞[4]

目前, 关于SCAP再生骨组织的研究还比较少, 在Wang等[22]的体外研究中, 发现胰岛素生长因子(insulin growth factor, IGF)-1可促进SCAP骨向分化, 抑制SCAP牙向分化。Wu等[23]的研究证实, 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)能增强SCAP的成骨分化。Chen等[24]研究发现, 无细胞羊膜基质的支架可以促进SCAP的成骨能力和矿化能力, 但其确切的调节机制仍有待进一步研究。此外, 细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)1/2通路的激活是羊膜诱导SCAP分化和矿化的表现之一。

4 牙周膜干细胞

牙周组织由牙龈、牙骨质、牙周膜和牙槽骨组成, 牙周膜作为牙周组织的重要组织部分, 在支持牙齿和调节牙槽骨方面起关键作用。PDLSC来源于牙周膜, 在一定的体外培养条件下可分化为牙周骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和成纤维细胞[8]。与其他的牙源性干细胞相同, PDLSC也具有快速生长和增殖的能力。但关于PDLSC的细胞生物学特性还不甚清楚。

通过酶消化法收集的PDLSC能够展现出较高的增殖率以及间充质干细胞特性, 而通过组织块培养法获得的PDLSC表现出成纤维细胞样特性。因此, 通过不同培养方法可获得具有不同特性的PDLSC, 对于探索新的干细胞治疗骨缺损疾病方案尤为重要。

对PDLSC的研究表明, 获得牙周膜细胞的来源有很多种。超过半数体内实验都使用犬作为获取PDLSC的来源, 并且在评估成骨潜能的牙周缺损模型中得到广泛运用。然而, Seo等[6]发现, 在大鼠牙周缺损模型中, 植入PDLSC 8周后, 未发现PDLSC产生新骨。伊班磷酸盐、辛伐他丁、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、低幅高频振动(low-magnitude high-frequency, LMHF)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)2、BMP6都可以增强PDLSC的成骨潜力[6, 25, 26, 27, 28]

PDLSC在骨组织工程方面应用广泛。Yamada等[29]的研究表明, 犬PDLSC能够修复直径10 mm以下的颌骨缺损, 并且在骨修复过程中形成更多的血管。有研究[30, 31]表明, 相较于牙龈间充质干细胞而言, PDLSC具有更大的成骨潜能。然而, Yang等[32]的研究表明, 在炎症情况下, 牙龈间充质干细胞比PDLSC有更好的成骨潜能。有研究[33]表明, 细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积的羟磷灰石支架可以显著增强体外PDLSC的成骨分化潜能。基于此, Ge等[34]将PDLSC分别接种在纳米羟磷灰石-壳聚糖支架和京尼平-壳聚糖支架上, 以评价其在体内的骨修复能力, 结果发现接种在纳米羟磷灰石-壳聚糖支架上的PDLSC的活性、碱性磷酸酶活性更佳; 同时, 骨相关的标记物骨涎蛋白、骨调素、骨钙素都明显上调。

5 牙囊前体细胞

牙囊是一个包围着萌出前牙胚的结缔组织囊, 内含牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞的祖细胞。这些祖细胞被局限在牙囊基质内, 可以从许多牙囊分离出来, 这就是所谓的DFPC, 也被称为牙囊来源性干细胞(dental follicle derived stem cell, DFSC)[7]。DFPC能够从尚未完全萌出的第三磨牙牙囊中分离出来。

与其他牙干细胞相似, DFPC是贴壁细胞和集落形成细胞, 在体外特定条件下能够分化成成骨细胞样细胞[35]。当在合适的体外条件下培养时, DFPC也具有分化为成骨细胞、成牙本质细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元的能力。

不同来源的DFPC的能力有所不同。有研究[36]显示, 使用猪或者鼠来源的DFPC修复骨缺损时缺乏新骨形成。Honda等[37]研究证实, 在鼠临界尺寸颅骨缺损修复实验中, 骨形成的过程类似于膜内骨化。另外, Dress等[38]发现, 丁酸盐可以刺激DFPC的早期成骨分化阶段, 与此同时抑制其生物矿化。

6 小结

总结DPSC、SHED、SCAP、PDLSC、DFPC这5种牙体组织来源性干细胞在体外及体内的成骨分化特性, 其确实有所差异。李琨等[39]在研究中发现, 小型猪来源的DPSC和PDLSC都具有较强的多向分化潜能和增殖活性, 但DPSC的成骨潜能相对较低。有学者认为, DPSC的成骨能力是有限的。有研究[40]发现, SHED与DPSC不同, 它可以诱导宿主细胞向骨组织分化的同时, 不形成牙本质-牙髓复合体结构。并且, 有研究者[41]在选用人的SHED和DPSC分别进行培养和成骨诱导后发现, SHED比DPSC具有更强的成骨分化能力。在骨组织再生方面, 使用牙体组织来源性干细胞是十分可行的。牙体组织来源性干细胞容易获得, 因此可以作为骨髓间充质干细胞的替代细胞用于临床治疗。然而, 牙体组织来源性间充质干细胞的增殖有限, 且随着体外扩增次数的增加会逐渐丧失分化能力。因此, 找到一种在维持牙体组织来源性间充质干细胞的生物特性的同时保留活性及分化能力的方法还需要进一步的研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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