C57BL/6J小鼠体外腭突悬浮培养过程中血小板衍化生长因子受体α的表达变化
丛雯雯, 张岱尊, 肖文林, 薛令法, 许尧祥
青岛大学附属医院口腔医学中心
[通信作者] 肖文林,副教授,博士,Email:wenlinxiao@sina.com

[作者简介] 丛雯雯,硕士,Email:406942174@qq.com

摘要

目的 构建C57BL/6J小鼠腭突体外培养模型,研究血小板衍化生长因子受体α(PDGFR-α)在小鼠腭突体外培养不同时间段的表达变化。方法 应用悬浮培养法分别培养腭突24、36、48 h,体视显微镜及苏木素-伊红(HE)染色观察腭突发育情况。免疫组织化学检测腭突体外培养不同时间段组织中PDGFR-α的表达定位,Western blot检测腭突体外培养不同时间段组织中PDGFR-α的时空表达变化。结果 体视显微镜和HE染色结果均显示,体外培养24 h,双侧腭突向中线方向靠近生长,间隙变窄;36 h,镜下观察到双侧腭突接触,HE切片观察到腭中嵴上皮缝的形成;48 h,镜下观察到双侧腭突融合,HE切片观察到腭中嵴上皮缝消失。PDGFR-α在腭突体外悬浮培养24 h时表达最高,36及48 h后逐渐降低。结论 本实验改进的腭突体外悬浮培养方法模拟了腭突的体内发育环境,为应用体外腭突培养模型研究腭裂复杂的发病机制奠定了基础。笔者采用的体外悬浮培养方法证明腭突发育相关基因 PDGFR- α在体外培养腭突的表达变化与其体内表达是一致的。

关键词: 血小板衍生化长因子受体α; 腭突; 悬浮培养
中图分类号:Q813.1+2    文献标志码:A      
Expression changes of platelet-derived growth factor receptor α in the process of palatal suspension culture of the C57BL/6J mouse in vitro
Cong Wenwen, Zhang Daizun, Xiao Wenlin, Xue Lingfa, Xu Yaoxiang
Stomatological Center, Affiliated Hospital of Qingdao University
Abstract

Objective This experiment builded in C57BL/6J mouse models of palatal process culture in vitro, to study the expression of platelet-derived growth factor receptor α (PDGFR-α) during different times.Methods Experiment cultured palates with the method of suspension culture for 24, 36, 48 h, palatal development was observed by stereomicroscope and hematoxylin-eosin (HE) staining. PDGFR-α expression location in different period was detected by immunohistochemical assays. The expression of PDGFR-α was examined by Western blot.Results Stereomicroscope and HE staining results showed that in vitro cultivation of 24 h, palatal process the space between bilateral palatal process reduced, bilateral palatal process contact and the crest epithelial seam could be seen in stereomicroscope and HE in 36 h, bilateral palatal process fusion and the crest epithelial seam disappearance could be seen in stereomicroscope and HE in 48 h. The expression level of PDGFR-α cultured palates for 24 h reached its peak and gradually reduced in 36 and 48 h.Conclusion The changes of PDGFR-α expression in cultivation of palatal process in vitro and in vivo had the same trend. In this study, improved method of suspension culture of palatal process in vitro simulated the development of the palatal process in vivo. The study had made a foundation for subsequent cleft palate of complex mechanismsd.

Keyword: platelet-derived growth factor receptor α; palatal; suspension culture

先天性唇腭裂是一种很常见的颌面部畸形, 近年来跃居颌面部畸形的首位, 其发病率为1/700[1]。唇腭裂是多因素疾病, 很多文献均报道遗传和环境的相互作用是先天性唇腭裂发生的危险因素[2, 3]。基因的缺失可能导致包括唇腭裂在内的一系列先天性发育畸形[4]

Soriano[5]指出血小板衍化生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)和血小板衍化生长因子受体α (platelet-derived growth factor receptor α , PDGFR-α )在颅颌面部发育尤其是腭发生、发育中具有重要作用。PDGFR-α 的表达具有时间和空间变化, 以及受到一些炎症因子的刺激会促进其表达增加的特征[6]。近年来, PDGFR-α 在人体胚胎发育过程中的作用被证实, PDGFR-α -/-小鼠模型表现出了面颊裂和骨缺损以及腭裂[7]。因此, 深入研究PDGFR-α 分子信号通路的表达调控机制, 为更好地了解唇腭裂的发生以及进一步理解发病机制提供诸多帮助。本项研究的前期实验[8]以C57BL/6J小鼠为研究对象, 进行了PDGFR-α 在小鼠体内腭突不同发育时期时间和空间上表达的检测。本实验构建了小鼠腭突体外悬浮培养模型, 检测PDGFR-α 在腭突体外培养过程中的表达变化, 并根据前期实验结果, 比较PDGFR-α 在体内、体外腭突发育中的表达差异, 以验证体外腭突悬浮培养的可行性。

1 材料和方法
1.1 研究对象

本实验采用无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级8~10周C57BL/6J近交系小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)作为研究对象。

1.2 主要仪器、试剂

DDulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’ s modified Eagle’ s medium, DMEM)/F121培养液(Hyclone公司, 美国); 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS; GIBCO公司, 美国); 35 mm培养皿(Falcon公司, 法国); 聚偏二氟乙烯(poly-vinylidene fluoride, PVDF)膜(Millipore公司, 美国); 显微外科器械(宁波医学仪器厂); 双目手术显微镜(SZ61TRC-LIST; Olympus公司, 日本); 石蜡轮转切片机(RM2235), 组织包埋中心(EG1150)(Leica公司, 德国); 兔抗鼠PDGFR-α 单克隆抗体, 小鼠抗人β -肌动蛋白(San- ta Cruz公司, 美国); 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)G、SP kit免疫组织化学试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司); Enhanced Western HRP Substrate, 5倍蛋白质加载缓冲液(武汉博士德公司); 蛋白质浓度测定试剂盒(南京赛泓瑞生公司)。

1.3 活体组织培养仪

参考Shiota等[9]的研究, 本实验改造了细菌涂布仪, 调整转速为20~25 r· min-1, 并增加了转速按钮。仪器的原装设置为当连接足踏开关时, 踩下足踏, 仪器旋转, 松开按钮, 旋转台停止工作。针对本次实验, 对仪器做了短路处理, 一旦在接线板上接上仪器电源, 仪器便按照设定好的转速开始工作(图1)。

图 1 旋转培养仪Fig 1 Rotating culture apparatus

1.4 C57BL/6J小鼠腭突的取材及培养

C57BL/6J小鼠20:00雌雄1:1合笼交配, 第2天8:00检栓, 有阴道栓者定为妊娠天(gestation day, GD)0.5, 根据之前的方法[10]取得GD13.5时小鼠胎头, 置于孔径为0.45 μ m滤膜的培养皿内。将提前调整好转速的活体组织培养仪放入含有5% CO2的培养箱中培养。每24 h换液, 培养液为含有10% FBS和双抗DMEM/F12的培养基, 在培养24、36、48 h后, 分别取出相应数量的腭突组织, 转移至体视显微镜下记录各个时期腭突发育情况, 甲醛溶液内进行组织固定48 h后行组织包埋固定。

1.5 组织切片苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色

取甲醛固定的体外培养腭突的标本, 经乙醇脱水后包埋蜡块。组织包埋后行石蜡切片制备, 在每个胚胎腭突的中1/3处取3 μ m连续切片, 70 ℃烤片机上加热烤片1 h。

1.6 免疫组织化学检测腭突体外培养不同时间段组织中PDGFR-α 的表达定位

使用0.01%多聚赖氨酸(poly-D-lysine, PDL)对即将免疫组织化学染色的切片进行预处理。各切片用二甲苯液处理3次; 无水乙醇梯度脱水; 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗原修复液进行高压修复; 3%过氧化氢孵育, 封闭内源性过氧化物酶; 滴加一抗后在37 ℃恒温水浴箱里孵育1 h; 滴加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体(二抗); 磷酸盐缓冲液(pho-sphate buffer solution, PBS)洗涤4次, 各组织切片上滴加新鲜配制的二氨基联苯胺溶液, 显色2 min; 苏木素染色2 s, 细胞核着色。再次乙醇梯度脱水后, 显微镜观察阳性结果, 统计阳性指标:以各个不同发育时期腭突细胞细胞质中出现黄色颗粒为阳性细胞。

1.7 Western blot检测PDGFR-α 在小鼠胚胎体外腭突培养过程中的表达变化

提取蛋白质, 保存至另一eppendorf管中, -20 ℃保存, 用酶标仪550 nm 测定吸光值, 计算测定结果。进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转膜, 孵育抗体, 置于成像系统中显色并拍照, 使用Image J软件分析图。每个实验重复3次。

2 结果
2.1 小鼠胚胎腭突器官的体外培养融合过程中标本的HE染色

实验发现, GD13.5时, 体外取出腭突组织后即刻固定, 双侧腭突呈垂直向生长(图2A); 体外培养24 h时, 双侧腭突逐渐靠近, 呈水平生长(图2B); 体外培养36 h时, 双侧腭突接触并形成腭中嵴上皮缝(medial epithelial seam, MES)(图2C); 体外培养48 h时, 双侧腭突完全融合, MES消失, 腭突间充质细胞均匀, 形成完整的上腭(图2D)。

图 2 不同胚胎腭突体外培养时期中的HE染色结果 × 40
A:GD13.5时, 体外取出的腭突组织; B:体外培养24 h时的腭突组织; C:体外培养36 h时的腭突组织; D:体外培养48 h时的腭突组织。
Fig 2 HE staining results during different culture stages of embryonic palate in vitro× 40

2.2 小鼠胚胎腭突器官的体外培养体视显微镜观察

在GD13.5时, 体视显微镜观察可见双侧腭突体积较小, 两腭突之间间隙较大, 口腔面可见鼻腔底部结构(图3A); 体外培养24 h后, 两侧腭突体积增大, 双侧腭突逐渐向水平方向靠近, 间隙明显减小(图3B); 体外培养36 h后, 双侧腭突继续靠近并接触(图3C); 体外培养48 h后, 双侧腭突与鼻腔侧完全接触融合, 口腔面可见完整的上腭(图3D)。

图 3 不同胚胎腭突体外培养时期中的体视显微镜观察结果 × 10
A:GD13.5; B:体外培养24 h; C:体外培养36 h; D:体外培养48 h。
Fig 3 The results of microscopic observation during different culture stages of embryonic palatein vitro× 10

2.3 PDGFR-α 在C57BL/6J小鼠胚胎腭突体外旋转培养融合过程中的表达定位

从图4可以看出, 在建立的小鼠体外腭突旋转培养模型中可以检测到PDGFR-α 在腭突体外培养的不同发育时期的表达具有动态变化的趋势。在GD13.5时, PDGFR-α 在垂直向生长的腭突中有较明显表达(图4A); 在GD14.5时, PDGFR-α 在整个水平向生长的腭突组织中弥散、强烈表达(图4B); 在GD15.0及GD15.5时, PDGFR-α 在腭突上皮及间充质中的表达逐渐减弱(图4C、4D)。

图 4 在小鼠胚胎腭突体外培养不同发育时期中PDGFR-α 的表达 × 40
A:GD13.5; B:GD14.5; C:GD15.0; D:GD15.5。PS:腭突; N:鼻子。
Fig 4 PDGFR-α expression during different culture stages of embryonic palate in vitro × 40

总体来看, 与本课题组前期体内腭突发育实验相比, 体外培养腭突器官PDGFR-α 的表达与正常体内发育的腭突的表达总体趋势一致。免疫组织化学检测体内小鼠正常腭突发育过程PDGFR-α 表达的实验研究结果参考本课题组仵素珍等[8]所进行的前期实验研究。

2.4 PDGFR-α 在小鼠胚胎腭突体外悬浮培养融合过程中的表达量变化

如图5、6所示, GD13.5时PDGFR-α 与GAPDH表达量的比值为1.165± 0.262; 体外培养24 h时, 达到高峰(2.692± 0.390); 随后36及48 h时, PDGFR-α 的表达逐渐降低。GD14.5与GD13.5相比较, P=0.004 9; GD15.0与GD14.5相比较, P=0.011 5; GD15.5与GD15.0比较, P=0.023 6, 以上差异均具有统计学意义。

图 5 Western blot检测胚胎腭突在体外培养的不同发育时期中的PDGFR-α 表达Fig 5 The expression of PDGFR-α during different culture stages of embryonic palatein vitro by Western blot analysis

图 6 Western blot检测不同胚胎腭突体外培养发育时期中PDGFR-α 与GAPDH表达量的比值Fig 6 Ratio of PDGFR-α to GAPDH was examined by Western blot during different culture stages of embryonic palate in vitro

3 讨论
3.1 小鼠腭突的体外悬浮培养

小鼠腭突体外培养方法自20世纪中期以来先后经历了金属栅栏式培养法[11]及Trowell培养法[12]等静止培养方法。1990年, Shiota等[9]建立了腭突悬浮培养法, 将腭突放入旋转培养仪内进行培养, 相比传统的静止培养法有较多的优点。首先, 取材方法不同, 悬浮培养法剪取腭突的方法是在体视显微镜下用显微眼科剪分别从胚胎口裂及眼裂做平行切口, 并不直接接触腭突, 避免对腭突造成损伤, 并且保留了上颌突及部分头部组织, 很大程度上保存了腭突的完整性, 也保证了体外腭突培养的成活率; 其次, 旋转培养仪器按照20~25 r· min-1旋转, 其中带有滤膜的组织随着仪器以相同的速度旋转, 组织因不断变化的重力矢量而保持悬浮状态, 不受任何主导生长方向的单个重力矢量的影响, 能够保持腭突组织细胞的分化和迁移, 在普通实验室内实现体外腭突三维培养模型的建立; 此外, 悬浮培养可以在体外观察到腭突的生长、抬高、接触及融合等过程[9]。此实验方法不仅减少了实验步骤, 同时为研究腭突正常发育和腭裂发病具体机制及成功筛检致畸原提供了一种实用的体外动物模型。

笔者应用此方法培养的腭突的形态学发育及融合过程与体内均极为相似。在胚胎第11.5 d时, 双侧腭开始从上颌突向外生长, 到胚胎体内发育第13.5 d, 双侧腭突开始于舌体上方朝向对侧生长。第14.5 d, 双侧腭裂突水平生长靠近, 体外培养24 h组的腭突(相当于GD14.5), 借助体视显微镜和HE染色也观察到了腭突的水平方向的生长, 生长发育与体内基本一致; 第15.0 d, 双侧腭突上皮细胞紧密接触并形成MES, 但观察到36 h组腭突(相当于GD15.0)有轻微差异, 36只体外培养的腭突中, 22只腭突中可以观察到MES, 14只腭突没有发现MES的存在, 但是双侧腭突之间的间隙与24 h组相比有所减小; 第15.5 d, 体内腭突发育最终完成, 实验中腭突体外培养48 h后(相当于GD15.5), HE染色观察到MES消失, 可见间充质细胞完全充满腭突组织中, 表示腭突完全融合, 最终完成腭的发育。因Shiota等[9]对旋转培养法所用相关培养设备没有详述, 笔者根据文献描述改造了检验科使用的细菌涂布仪, 并针对转速等进行了相应设置, 经实验应用表明所培养的胚胎腭突融合过程与体内腭突发育一致, 并与文献报道的体外培养腭突结果一致, 表明笔者设计的旋转培养仪可以应用于体外腭突培养。此旋转培养仪已经申请发明专利。

3.2 PDGFR-α 与腭突发育的关系

Satokata指出PDGF信号通路与人类先天性唇腭裂的形成相关, 在小鼠体内, 血小板衍生生长因子C(platelet derived growth factor C, PDGFC)缺失会导致唇腭裂的发生, 这是人类第一次提出了关于PDGF信号通路与发育缺陷之间的关系。 Tiwari等[13]指出, PDGFC信号通路与唇腭裂的发生与致畸因子维甲酸密切相关, 添加外源性维甲酸可引起腭突障碍, 同时使PDGFR-α 的表达量下降。因此, 笔者推论在人类胚胎发育过程中, PDGFR-α 基因的突变会导致先天性唇腭裂的发生。

在前期实验[8]研究中, 依次取得GD13.5、GD14.5、GD15.0和GD15.5的小鼠胎头, 通过Western blot方法检测PDGFR-α 在腭突不同发育时期的表达变化, 结果均表明在GD14.5时PDGFR-α 的表达最高。后期实验研究证明, 在体外培养的小鼠腭突的不同的发育时期, 即GD13.5的小鼠胚胎, 体外分别培养24、36、48 h, 运用了同样的检测方法, 结果表明, 体外培养的小鼠腭突的表达变化与体内正常发育的小鼠胚胎的表达量基本相似, 实验结果显示在体外培养了24 h后, 即相当于体内正常发育的第14.5 d, Western blot检测反映出PDGFR-α 表达最为明显。进一步验证了体内、体外的PDGFR-α 表达的一致性。与前期小鼠体内腭突发育的HE实验研究结果比较发现, 通过活体组织培养器悬浮培养, 形态学发育及融合过程与体内极为相似。

The authors have declared that no competing interests exist.

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