硅酸镁锂在骨组织工程中的研究进展
梁馨予, 石佳博, 陈文川, 朱智敏
口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院修复1科 成都 610041
[通信作者] 朱智敏,教授,博士,Email:zzhimin@163.com

[作者简介] 梁馨予,博士,Email:1362171184@qq.com

摘要

硅酸镁锂是一种纳米黏土材料,因其具有的细胞水平大小、带电片晶结构和较高的表体积比,易与蛋白分子、细胞、聚合物交联。随着对硅酸镁锂研究的不断深入,近年来该材料已逐渐发展到骨组织工程领域。本文以硅酸镁锂的物理化学性质和生物学性质为基础,对骨组织工程中硅酸镁锂对种子细胞功能调控、生长因子递载以及基质材料改良的研究进展作一综述,以期为该材料在骨组织工程中的应用研究提供参考。

关键词: 硅酸镁锂; 骨组织工程; 成骨诱导; 载体; 基质材料
中图分类号:R783.1    文献标志码:A      
Research progress on synthetic nanosilicates in bone tissue engineering
Liang Xinyu, Shi Jiabo, Chen Wenchuan, Zhu Zhimin
State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Dept. of Prosthodontics 1, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract

Synthetic nanosilicates are clay nanoparticles that have a cellular-level size, distinct charged and layered structure, and high surface-to-volume ratio, which enhances their interactions with proteins, cells, and polymers. Recently, researchers have focused on the implications of using synthetic nanosilicates in bone tissue engineering to understand their physicochemical and biological properties. The scope of this review includes the well-established use of synthetic nanosilicates for the adjustment of cell functions during bone tissue engineering. The interactions of synthetic nanosilicates with growth factors enable controlled delivery, and their mechanical or biological properties are enhanced when they interact matrix materials. This review is useful to future studies on synthetic nanosilicates.

Keyword: synthetic nanosilicates; bone tissue engineering; osteoinduction; carrier; matrix material

骨组织具有再生能力, 正常情况下是能自我修复并持续进行生理性改建的硬组织。但创伤或疾病引起较大骨缺损时, 在局部感染、血供不足或系统性疾病等因素的作用下, 自身骨再生能力有限, 骨愈合出现延迟, 甚至不愈合。这时, 通过在骨缺损区植入骨移植材料, 可促进和支持新骨再生。而成骨效果最佳的骨移植材料是自体骨, 因其兼具骨移植材料成骨的三大特性, 即骨生成性、骨诱导性和骨传导性[1]。但自体骨移植的二次手术创伤及术后并发症, 促使了大量以代替自体骨为目的的骨组织替代材料的发展, 如金属类材料、活性陶瓷、可降解高分子材料、成骨诱导性复合材料等[2]。但与自体骨相比, 这些骨替代材料的成骨生物活性仍有待提高。

为制造出更接近自体骨的骨替代材料, 近年来以构建包含成骨前体细胞、生长因子、营养供给的骨组织工程材料逐渐成为焦点[3]。理想的骨组织工程材料需模拟骨组织胞外基质, 为新骨形成提供空间和营养支持, 并能随着新骨的成熟逐渐降解[4]。在此背景下, 硅酸镁锂作为一种新型无机纳米生物材料逐渐进入研究视野。该材料除了兼备较高的表面体积比、表面带电活性、可塑凝胶性、触变性等特性, 还具有体内生物安全性、可降解性、生物相容性、成骨诱导性以及生物分子递载和对基质材料的改良能力等生物材料优势, 使其成为极具应用潜能的骨组织工程材料[5, 6, 7, 8]。本文对硅酸镁锂在骨组织工程应用中的研究进展加以归纳、阐述, 并展望该材料未来的应用发展。

1 硅酸镁锂的结构

硅酸镁锂是由镁盐、锂盐和硅酸盐通过水热法合成的白色粉末状无机物, 在水中可分散为单个超薄纳米片状晶体。其基本结构单元是由两个四面体二氧化硅片层内夹一个镁、锂离子组成的八面体片层而形成的2:1型片状晶体, 为Na+0.7[(Mg5.5Li0.3)Si8O20(OH)4]-0.7[9, 10, 11]。单个硅酸镁锂片状晶体直径约为25 nm, 厚度约为1 nm, 是纳米级二维结构无机物。仅数个原子层厚度, 较小的轴径比, 使其有较大的表面体积比, 因而与石墨烯、二硫化钼、二氧化钛等材料一起归为2D纳米材料, 均具有最佳的表面交联性优势[7]

2 硅酸镁锂的物理化学性质

硅酸镁锂片晶结构因内部离子交换作用使表面带负电荷, 边缘的羟基使水分子极化而局部带正电荷。硅酸镁锂的表面带电性与活性基团, 使其可与细胞、生物分子以及聚合物以非共价键或共价键的形式相交联。同时, 硅酸镁锂的带电性和各向异性, 还利于晶体间带负电荷的平板面与带正电荷的边缘相互吸附, 促使晶体自主聚集成网, 使其具有可塑凝胶性和触变性。低浓度的晶体水分散液中, 静电斥力能避免晶体聚集, 形成透明、稳定的分散液, 此时, 晶体总表面积达到最大值[12]。浓度稍高后, 分散的硅酸镁锂片状晶体, 在电荷力作用下自主聚集, 形成开放、多孔、可逆的水凝胶三维网状结构[13]。但剧烈的搅拌可剥离晶体间的吸附, 使水凝胶恢复为分散液[12]。此外, 增加离子浓度, 降低pH值或升高温度, 都会使晶体自主聚集形成水凝胶[12]。因此, 该材料分散液一旦被注入体内, 在生理盐浓度环境中可迅速自主地聚集, 局部组装成三维网状结构。以上特性使硅酸镁锂能以可注射水凝胶的形式, 应用于有生物低侵入性要求的种子细胞、生物分子递载[14]; 同时, 还可作为聚合材料的改性剂, 扩宽传统骨组织工程材料的应用范围。

3 硅酸镁锂的生物学性质
3.1 生物安全性

硅酸镁锂的组成元素是健康人体所必需的, 且降解产物具有成骨调节作用。该材料的体内降解产物Mg2+, 能调节整合素家族蛋白, 在细胞黏附过程中发挥着重要作用[15]; Si(OH)4可促进胶原Ⅰ 蛋白合成及矿化; Li+可激活Wnt信号通路并调节转录因子Runx2的表达[5]。研究[5, 6]发现:硅酸镁锂浓度达到1 mg· mL-1时, 开始对细胞代谢活力有阻碍作用。但与其他纳米级生物活性材料, 例如羟磷灰石纳米颗粒[直径=50 nm, 半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)=250 μ g· mL-1][16]、二氧化硅纳米颗粒(直径=30 nm, IC50=400 μ g· mL-1[17, 18]相比, 硅酸镁锂的IC50=4 mg· mL-1, 仍是其10倍多[5]。而用浓度小于100 μ g· mL-1的硅酸镁锂培养人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cell, hMSC)28 d的观察中, 未检测到细胞活性氧、活性氮、乳糖脱氢酶等细胞应激反应物高表达以及形态变异[5]。可见, 硅酸镁锂是一种更安全的生物活性材料, 但仍需要体内试验的长期验证及对致癌、致畸可能性的深入探索。

3.2 生物相容性

大量研究[19, 20]揭示硅酸镁锂能有效提升骨组织细胞的黏附和增殖。在硅酸镁锂烧制的生物陶瓷表面, 大鼠骨髓间充质细胞(rat mesenchymal stem cell, rMSC)能更好地贴附生长, 并促进模拟体液中羟磷灰石沉积于陶瓷表面[21]。此外, 仅添加质量百分含量为2.5%的硅酸镁锂, 即能使本不支持细胞黏附的聚乙二醇水凝胶膜获得支持hMSC黏附及增殖的能力[22]。在不支持黏附的聚氧化乙烯凝胶膜内添加硅酸镁锂后, 可促使成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1细胞和rMSC黏附和增殖, 并提高了骨钙素(osteocalcin, Ocn)的表达, 其效果仍具有浓度依赖性[19, 20, 23, 24]。有研究[5]显示:低浓度硅酸镁锂分散液(< 100 μ g· mL-1)对hMSC和表达SSEA-4阳性的人脐带间充质干细胞(SSEA-4+human adipose tissue-derived stem cell, SSEA-4+hASC)的形态无明显影响; 而浓度稍高时, 晶体聚集成簇覆盖于细胞表面, 使细胞骨架回缩, 导致细胞形态改变。可认为, 在一定的浓度范围内, 硅酸镁锂不会影响骨组织细胞的形态改变且能促进细胞黏附、增殖并具浓度依赖性, 可为骨组织工程种子细胞的生长提供一个安全的支持环境, 其机制可能与硅酸镁锂的纳米片晶结构、对黏附因子的吸附, 以及与细胞结合位点有关[19, 20, 23, 24]

4 硅酸镁锂的生物应用改性

因上述硅酸镁锂所具有的特性, 如纳米级别大小, 对环境离子浓度、pH值、温度的敏感性, 表面较强硅羟基的单一性等, 使该材料在应用于生理环境时, 更易面临网状内皮系统的吞噬、材料局部聚集过密, 以及表面生物活性单一等问题。对此, 有学者已通过稳定表面电荷、增加外边缘层或引入修饰官能团的方式, 对部分问题进行了改善。有研究[25]利用复合凝胶中阳性的聚氨乙基甲基丙烯酸酯部分, 完全中和硅酸镁锂表面的负电荷, 实现并维持了硅酸镁锂在高离子强度水溶液中的均匀分散。类似地, 通过缠绕聚丙烯酸钠于晶体阳性边缘, 也可破坏硅酸镁锂的聚集, 实现均匀分散[26]。另外, 聚乙二醇化后的硅酸镁锂以在片晶周围形成外边缘层的形式, 稳定了硅酸镁锂在生理离子强度下的均匀分散状态的同时也隐匿了该晶体, 避免了被网状内皮系统的识别与吞噬[27]。而晶体边缘单一的硅羟基可通过与烷氧基硅烷反应, 引入伯胺、叔胺、甲基丙烯酸酯、苯甲酮等多种活性基团, 为合成多功能的无机/有机复合纳米材料提供可能[28]

5 硅酸镁锂在骨组织工程中的应用
5.1 硅酸镁锂直接促成骨的作用

硅酸镁锂在介质中的聚集情况随介质中离子强度的变化而改变, 在生理离子强度下, 晶体聚集形成离散的球状微胶囊, 其平均直径为170 µ m, 适合对单个骨组织工程种子细胞的封装[14]。封装过程仅需将细胞混匀在低浓度硅酸镁锂的分散液里, 随后直接加入到培养基中, 在培养基离子强度下晶体可完成自组装, 聚集形成微胶囊封装细胞。硅酸镁锂对骨组织工程种子细胞的封装能隔离宿主免疫, 保护植入细胞不受免疫系统的攻击, 同时吸附了大量基质蛋白的硅酸镁锂为封装的细胞营造了更好的基质环境并与细胞生物结构交互作用, 调控种子细胞[10], 为骨组织工程种子细胞提供兼具安全性和生物活性的微环境[29]。此外, 染色标记硅酸镁锂的观察[5, 6, 19]显示:随着培养基中硅酸镁锂浓度的升高, 细胞内该晶体出现增多, 胞内肌动蛋白显影更清晰, 且硅酸镁锂的胞内分布与细胞骨架重叠, 表明硅酸镁锂可被成骨前体细胞内吞, 其胞内作用机制与细胞骨架联系紧密。因此, 该材料可能通过胞外交互或被内吞进入胞内, 激活细胞骨架-生物通路, 实现了对骨组织工程种子细胞的调控。

硅酸镁锂可成骨诱导骨组织工程种子细胞, 促进细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、Runx2、Ocn的基因高表达。对SSEA-4+hASC的研究[6]揭示:浓度低于100 μ g· mL-1的硅酸镁锂可显著诱导种子细胞成骨分化并具有剂量依赖性。在普通培养基、成骨支持培养基(添加β -甘油磷酸盐、抗坏血酸盐)、成骨诱导培养基(添加地塞米松、β -甘油磷酸盐、抗坏血酸盐)中构建硅酸镁锂浓度梯度的分组实验中也表明:在无任何成骨诱导因子的情况下, 一次性小剂量(10 μ g· mL-1)添加硅酸镁锂即可有效诱导hMSC成骨分化, 促进ALP表达、胞外基质矿化, 并激活成骨标记物Runx2、Ocn、骨桥蛋白(osteopon-tin, Opn)表达。该作用机制可能与硅酸镁锂的降解产物相关。骨组织工程中直接添加生长因子或激素类药物, 虽能有效促进成骨, 但仍存在分子局部定位欠佳、生物活性时间短的问题, 导致临床实际有效用量需大于机体正常的生理量, 而出现不良反应和治疗费用高的新问题[30]。而硅酸镁锂在缺乏成骨诱导因子的环境中, 依旧具有高效的成骨诱导力, 此研究结果为骨组织工程利用无机物安全调节种子细胞促成骨提供了新思路, 有望解决以上的问题。此外, 硅酸镁锂仍展现出较好的血凝诱导能力[31], 能加快血凝块的形成, 保护创口, 防止感染的同时为骨创伤区域骨再生创造有利的条件。

目前, 已有将硅酸镁锂分散于生物材料中, 制成具有促成骨功能的新型骨组织工程支架材料的研究报道。研究结果显示:将硅酸镁锂与乳酸-羟乙醇酸共聚物或环氧乙烷交互制成的细胞支架材料, 能在缺乏成骨诱导因子的培养基中促进hMSC、MC3T3-E1的黏附、延展、增殖以及成骨分化。而直接将硅酸镁锂烧结而制成的硅酸镁锂生物陶瓷材料也显示出在缺乏成骨诱导因子的培养基中对rMSC仍有明显的促成骨分化作用, 而动物实验更进一步证实了该材料对机体的生物安全性以及对骨缺损的修复效果。

此外, 硅酸镁锂/明胶的复合材料可提高77%的凝血速度, 形成稳定的血凝块[32, 33, 34], 为成骨提供前期条件。

5.2 硅酸镁锂的递载作用

硅酸镁锂的高活性表面, 能与蛋白质良好地交联。在Dawson等[14]的研究中, 分别制备白蛋白、溶菌酶与硅酸镁锂及藻酸盐的混合水凝胶, 加入适量磷酸缓冲盐(phosphate buffer saline, PBS)溶液中, 监测60 h内释放的蛋白质含量变化, 结果显示:藻酸盐实验组的溶液中蛋白质含量随时间延伸先以指数级增加后趋于稳定; 而硅酸镁锂组72 h监测中, 溶液中蛋白质含量始终保持在极低水平, 表明硅酸镁锂对所交联蛋白质极佳的锚定能力。另一方面, 通过向蛋白质-PBS溶液中均匀添加硅酸镁锂水凝胶, 测定一段时间该溶液中蛋白质含量的变化, 以确定硅酸镁锂对蛋白质的吸附能力, 结果发现:硅酸镁锂的加入使溶液中蛋白质含量急剧下降直至72 h后几乎不能测到其有效含量, 而再往溶液中添加蛋白质至总浓度达硅酸镁锂的2倍时, 水中蛋白质含量仍未明显升高。以上的研究证明了硅酸镁锂对蛋白质极强的吸附、锚定能力, 此特性利于该材料对骨组织工程中生长因子的递载。

目前, 已有少量利用硅酸镁锂凝胶或其与聚合物的复合凝胶递载骨组织工程生长因子的探索性研究出现。研究中, 将硅酸镁锂凝胶膜在含血管内皮生长因子的培养基中浸泡2 h后, 经2次PBS溶液冲洗, 在该膜表面接种的人脐静脉内皮细胞有明显成血管反应[14]。动物研究[14]也证实:用硅酸镁锂加载血管内皮生长因子, 促血管新生的效果显著, 且高于硅酸镁锂与生长因子单一作用效果之和。此外, 通过在合成的硅酸锂镁/胶原纤维复合膜上递载骨形态发生蛋白-2(bone morpho-genetic protein-2, BMP-2)解决了胶原纤维这类亲水性聚合物对所加载的因子在短时间内就大量释放的缺陷, 实现了对BMP-2的定点稳定释放, 提高了生长因子的利用效率, 降低其因超生物剂量使用而带来的不良反应[35]。因此, 硅酸镁锂的高表面活性可应用于骨组织工程递载材料的开发, 未来硅酸镁锂材料可独自或与聚合物复合实现对成血管因子和成骨因子等骨再生因子的递载, 并将该因子靶向缓释于骨缺损区域, 为骨组织工程生长因子递载及血管化的解决提供了新策略。

5.3 硅酸镁锂支架材料的改良作用

骨组织工程支架材料是递载种子细胞和生长因子, 并为骨再生提供稳定空间支持的三维细胞龛生物活性材料。而聚合物凝胶材料如聚丙烯酸甲酯、聚乙烯醇, 与细胞外基质结构及物理化学性质相似, 具有良好的渗透性和生长因子递载能力, 能维持细胞与基质的正常代谢交换[14, 36, 37], 是一类理想的骨组织工程支架材料。但这些聚合物凝胶存在弹性模量低、易降解、对递载分子锚定能力弱、促成骨能力弱等问题, 而添加硅酸镁锂纳米颗粒能优化聚合物凝胶材料的力学性质。添加硅酸镁锂纳米颗粒后的基丙烯酰胺具有更佳的强度、弹性模量和韧性, 该原理与硅酸镁锂作为非共价交联剂能消散材料形变时的应力有关[38]。质量百分含量为30%的硅酸镁锂纳米颗粒的添加, 即可使基丙烯酰胺材料的弹性模量提高360倍, 达43 MPa, 这是已报道弹性模量最高的聚合物凝胶, 该强度可实现对软骨组织再生的支持[9]; 同时, 硅酸镁锂与聚二乙醇交互形成弹性网状结构复合物, 该复合物随着硅酸镁锂含量的增加, 其韧性、断裂应力、极限应变都有显著提高, 其伸长率可达到2 000%。此外, 硅酸镁锂的加入可使胶原基质凝胶的网状结构刚性增强, 并增加材料的多孔性, 该复合材料可在无生长因子的情况下诱导成骨前体细胞成骨分化和基质矿化[39, 40]。电纺丝可被用来合成纤维支架, 作为又一类骨组织工程的支架材料。有研究通过将静电纺丝与硅酸镁锂复合能形成直径更细的纤维, 从而制作出纤维排列更紧密、空隙更少的纤维支架材料。同时, 随着硅酸镁锂的添加, 形成的纳米纤维有更高的抗张强度与杨氏模量, 但也增加了纤维的脆性。

6 小结

硅酸镁锂能支持细胞的黏附、增殖, 并易于与骨组织工程种子细胞、生长因子、基质材料产生交联作用。此外, 硅酸镁锂有良好的成骨诱导性, 单次、少量添加即可显著促进成骨分化, 可作为生物安全且便宜的无机纳米成骨活性材料使用, 避免因用生长因子或激素类分子促成骨可能导致的生理不良反应[5, 6]。因此, 硅酸镁锂可通过3种途径应用于骨组织工程中:1)直接替代传统成骨诱导因子, 调控种子细胞成骨分化; 2)以单一或复合水凝胶的形式利用其可塑凝胶性, 以生物低侵入性的方式递载成骨相关因子; 3)支架材料的改性剂, 使之具有适宜的力学性能和特殊的生物活性。

硅酸镁锂目前在骨组织工程领域的研究结果, 展现出该材料未来在该领域广泛的应用潜能。但硅酸镁锂在骨组织工程中的研究仍处于初始阶段, 与种子细胞的作用机制仍待深入探索, 递载生物分子的类型及方法亟待完善, 对基质材料的改性研究还不多, 且该材料目前的生物研究大部分停留于体外实验阶段, 对材料长期于机体内的降解情况、致癌性以及免疫反应还认识不足。但相信随着对该材料研究的深入, 未来能充分利用其生物性能设计出更多有针对性的骨组织工程材料, 以满足临床的各种特殊需求。

The authors have declared that no competing interests exist.

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