口腔鳞状细胞癌患者唾液和血清中N-α-乙酰基转移酶10的水平及其临床意义
余芯乐1, 郑军1, 徐江1, 曾妍2
1.石河子大学医学院第一附属医院口腔科 石河子 832003
2.石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室 石河子 832003
[通信作者] 曾妍,副教授,博士,Email:yzeng910@163.com

[作者简介] 余芯乐,硕士,Email:228812761@qq.com

摘要

目的 探讨N-α-乙酰基转移酶10(Naa10)在口腔鳞状细胞癌患者和正常人的唾液和血清中的水平及其临床意义。方法 应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测口腔鳞状细胞癌患者和正常人的唾液和血清中Naa10的水平,并分析Naa10水平与口腔鳞状细胞癌患者年龄、性别、族别、分化程度、临床分期、肿瘤转移等临床参数的相关性,绘制接受者操作特征(ROC)曲线评价唾液、血清中Naa10水平在口腔鳞状细胞癌诊断中的应用价值。结果 口腔鳞状细胞癌患者的唾液和血清中Naa10水平均高于正常对照组。无论是口腔鳞状细胞癌患者还是正常人,唾液中Naa10水平都高于血清中。口腔鳞状细胞癌患者血清中Naa10水平在不同年龄组的差异具有统计学意义( P<0.05),唾液中Naa10水平在不同分化程度组的差异具有统计学意义( P<0.05),其余差异无统计学意义。通过ROC曲线评价唾液和血清中Naa10水平,其ROC曲线下面积分别为0.924、0.713,此时两组灵敏度、特异度和准确度分别为85.4%、85.0%、85.3%和74.2%、65.0%、72.1%。结论 检测唾液和血清中的Naa10水平可用于协助诊断口腔鳞状细胞癌,且其在唾液中的灵敏度和特异度更优于血清。唾液中Naa10水平与分化程度相关,可能为判断口腔鳞状细胞癌恶性程度提供帮助。

关键词: 口腔鳞状细胞癌; 唾液; 血清; N-α-乙酰基转移酶;; 酶联免疫吸附测定
中图分类号:R739.8    文献标志码:A      
Level of N-α-acetyltransferase 10 in saliva and serum of patients with oral squamous cell carcinoma and its clinical significance
Yu Xinle1, Zheng Jun1, Xu Jiang1, Zeng Yan2
1. Dept. of Stomatology, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Shihezi University, Shihezi 832003, China
2. Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease, Shihezi University, Shihezi 832003, China
Abstract

Objective To detect the level of N-α-acetyltransferase 10 (Naa10) in the saliva and serum of patients with oral squamous cell carcinoma (OSCC) and normal adults, and to explore its clinical significance. Methods Using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the levels of Naa10 in the serum and saliva of OSCC patients and normal adults, the correlation between the level of Naa10 and age, gender, nationality, histological grade, clinical stage and tumor metastasis were analyzed. To evaluate the value of salivary and serum Naa10 in the diagnosis of OSCC by receiver operating characteristic (ROC) curve.Results The levels of Naa10 in saliva and serum of patients with OSCC were higher than those in normal controls. In both patients with OSCC and normal controls, salivary Naa10 was higher than serum Naa10. Level of Naa10 in serum was correlated with the age of OSCC patients ( P<0.05). Level of Naa10 in saliva was correlated with the histological grade of OSCC patients ( P<0.05). But there was no statistical difference between the other pathological parameters and Naa10 levels in saliva and serum. The area under the ROC curve of Naa10 in saliva and serum was 0.924 and 0.713. In saliva and serum, the sensitivity, specificity and accuracy of Naa10 were 85.4%, 85.0%, 85.3% and 74.2%, 65.0%, 72.1%. Conclusion Detection of Naa10 levels in saliva and serum is useful in diagnosis of OSCC, and its sensitivity and specificity in saliva are better than those in serum. The level of Naa10 in saliva is related to the degree of differentiation, which may help to determine the degree of malignancy of OSCC.

Keyword: oral squamous cell carcinoma; saliva; serum; N-α-acetyltransferase;; enzyme-linked immunosorbent assay

尽管近年来对口腔癌的手术治疗、放射治疗和化学治疗技术都在不断进步, 但口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma)作为口腔颌面部恶性肿瘤中最常见的恶性肿瘤, 其患者的5年生存率仍然不到50%[1], 因此口腔鳞状细胞癌的明确诊断和早期治疗对提高患者生存率至关重要。随着分子诊断技术的发展, 越来越多的肿瘤标志物被发现, N-α -乙酰基转移酶(N-α -acetyltransfe- rase, Naa)10也引起了广泛关注。Naa10大量存在于真核细胞中, 对蛋白质进行修饰, 通过与多种蛋白质协同作用, 影响着细胞增殖、凋亡、转移、自噬等多种生物学过程。文献[2]报道, Naa10在甲状腺癌、结直肠癌、乳腺癌等多种癌症中均高水平表达。笔者所在课题组前期研究[3]结果证实, Naa10在口腔鳞状细胞癌组织中也过表达。本研究通过测定Naa10在口腔鳞状细胞癌患者和正常人的唾液、血清中的水平, 以探讨唾液和血清中Naa10水平对口腔鳞状细胞癌诊断的意义。

1 材料和方法
1.1 临床资料

本研究获得石河子大学医学院第一附属医院伦理审查委员会批准。经石河子大学医学院第一附属医院口腔科及新疆医科大学第一附属医院口腔科2013— 2016年病理诊断确诊为口腔鳞状细胞癌的患者为口腔鳞状细胞癌组, 收集该组唾液76例, 其中男44例, 女32例, 年龄21~83岁, 平均(62.1± 3.21)岁; 同时收集该组血清66例, 其中男37例, 女29例, 年龄21~83岁, 平均(61.9± 4.67)岁。口腔检查确诊无溃疡、牙周疾病及全身检查无系统性疾病的健康人为正常对照组, 收集该组唾液36例, 其中男19例, 女17例, 年龄20~ 79岁, 平均(60.8± 3.90)岁; 同时收集该组血清26例, 其中男14例, 女12例, 年龄24~82岁, 平均(59.7± 5.26)岁。两组间在性别、年龄的差异无统计学意义, 具有可比性。

1.2 标本收集

所有标本的采集事先征得受检者知情同意。

唾液标本收集:为减少食物残渣对唾液的影响, 采集时间为晨9:00— 10:00, 采集前5 min漱口, 留取未经刺激的唾液1~2 mL, 采集后立即加入蛋白酶抑制剂, 封口后冻存于-80 ℃备用。

血清标本采集:在采集66例口腔鳞状细胞癌患者唾液标本后, 抽取其静脉血2 mL。正常对照组26例血清来自体检的健康人员。采集血液后立即离心取血清, 封口后冻存于-80 ℃备用。

1.3 实验方法

1.3.1 主要试剂 Naa10酶联免疫吸附测定(enzy-me-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(DL-NAA10-Hu ELISA; 无锡东林科技发展有限责任公司)。

1.3.2 检验方法 将试剂标准品和唾液、血清样品分别加入酶标板的标准品孔和样品孔中, 封板, 37 ℃温育2 h; 移去每孔中的液体, 每孔加入检测溶液A 100 μ L, 封板, 37 ℃温育1 h, 弃溶液, 洗板3次, 每次放置1~2 min; 每孔加入检测溶液B 100 μ L, 再次封板, 37 ℃温育1 h, 洗板5次; 每孔加入酶标试剂90 μ L, 换新封板膜, 37 ℃避光温育15~25 min; 每孔加终止液50 μ L终止反应。然后在波长450 nm读取酶标板上各孔的光密度(optical density, OD)值。根据标准品的OD值绘制标准曲线, 通过样品的OD值计算其对应的浓度值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析, 计量资料数据以平均值± 标准差表示, 采用t检验分别比较Naa10在口腔鳞状细胞癌患者、正常人的唾液和血清中水平的差异及与临床参数(包括性别、年龄、族别、分化程度、临床分期、是否淋巴结转移)之间的差异, 以P< 0.05为差异具有统计学意义。绘制接受者操作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线, 分析评价唾液和血清中Naa10水平检测对口腔鳞状细胞癌的诊断价值, 使用Youden指数计算灵敏度、特异度。各指标间 ROC曲线下面积的比较采用Z检验, 以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 Naa10在口腔鳞状细胞癌组、正常对照组的水

平经t检验得出, 口腔鳞状细胞癌组与正常对照组唾液、血清中的Naa10水平均存在统计学差异(P< 0.05)。无论是唾液还是血清, 口腔鳞状细胞癌组中Naa10水平均显著高于正常对照组。无论是口腔鳞状细胞癌患者还是正常人, 唾液中Naa10水平均显著高于血清中(表1)。

表 1 口腔鳞状细胞癌患者组与正常对照组唾液和血清中Naa10水平 Tab 1 Naa10 levels of serum and saliva in OSCC pa-tients and healthy controls
2.2 口腔鳞状细胞癌组中Naa10的水平与临床参数之间的关系

口腔鳞状细胞癌组76例唾液中, Naa10水平在不同分化程度上的差异具有统计学意义(P< 0.05), 在患者不同年龄、性别、族别、临床分期、肿瘤转移情况上的差异无统计学意义(P> 0.05)。口腔鳞状细胞癌组66例血清中, Naa10水平在年龄上的差异上有统计学意义(P< 0.05), 在患者不同性别、族别、分化程度、临床分期、肿瘤转移情况上的差异无统计学意义(P> 0.05)(表2)。

表 2 口腔鳞状细胞癌组中Naa10水平与各相关临床参数分析 Tab 2 The Naa10 levels and clinical parameter in OSCC
2.3 ROC曲线分析

口腔鳞状细胞癌组66例及正常对照组20例均检测了唾液和血清中Naa10的水平。以病理学检查结果为金标准, 通过SPSS 17.0软件将检测结果绘制成 ROC 曲线(图1)。唾液中Naa10的ROC曲线下面积为0.924, 其标准误差为0.028, 95%可信区间为(0.869~0.979)。血清中Naa10的ROC曲线下面积为0.713, 其标准误差为0.062, 95%可信区间为(0.592~0.834)。唾液中Naa10的ROC曲线下面积明显大于血清中, 差异有统计学意义(P< 0.05)。当Youden指数值最大时, 所测得的值即为最佳临界点。唾液和血清中Naa10的最佳临界值分别为83.20和41.11 pg· mL-1, 此时计算灵敏度、特异度、准确度(表3)。综合评价各指标, 唾液中Naa10各诊断指标均优于血清中Naa10。与血清中Naa10相比, 唾液中Naa10更适合作为诊断口腔鳞状细胞癌的单项指标。

图 1 唾液、血清Naa10检测用于诊断口腔鳞状细胞癌的ROC曲线Fig 1 ROC curve of Naa10 in saliva and serum for the diagnosis of oral squamous cell carcinoma

表 3 唾液和血清中Naa10用于诊断口腔鳞状细胞癌的临床诊断性能评价 Tab 3 The clinical evaluation of Naa10 in saliva and serum for the diagnosis of oral squamous cell carcinoma
3 讨论

N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferase, Nat)A复合体是真核生物最主要的N-氨基酸-α -乙酰基转移酶。Naa10作为NatA唯一具有催化活性的亚基, 在人体多种组织内均有表达; 在细胞中的分布取决于细胞的种类, 大多情况下存在于细胞质中, 在细胞核中偶有分布。Naa10与多种信号蛋白均有协同作用, 影响着细胞的多个生物学过程。

近年来发现Naa10在多种肿瘤组织中高表达, 其能够解除细胞周期阻滞, 促进肿瘤细胞增殖, 同时能抑制肿瘤细胞迁移与侵袭; 能促进肿瘤细胞自噬, 也能促进或抑制肿瘤细胞凋亡[2, 4, 5, 6]。说明Naa10在不同种类、不同阶段的恶性肿瘤中扮演着不同的角色, 发挥不同的作用。但关于口腔鳞状细胞癌患者唾液和血液中Naa10水平的研究目前仍较少, 笔者通过本研究发现, 口腔鳞状细胞癌组唾液和血清中Naa10水平均显著高于正常对照组, 与本课题组[3]前期在口腔鳞状细胞癌组织中发现Naa10水平远远高于口腔正常黏膜组织的研究结果相符, 提示Naa10可能在口腔鳞状细胞癌中发挥重要作用, 作为一种新的肿瘤标志物被用于口腔鳞状细胞癌的诊断。

本研究根据年龄、性别、族别、分化程度、临床分期及有无淋巴结转移对口腔鳞状细胞癌组分组, 对比各组唾液及血清Naa10水平发现, 血清中Naa10水平与年龄有关。近30年研究[1, 7]发现, 口腔鳞状细胞癌多发于40岁以上人群, 发病率随年龄增长而升高, 表明年龄是口腔鳞状细胞癌发病的影响因素之一。唾液中Naa10的表达与分化程度有关, 唾液中Naa10的水平随病理恶性程度的升高而明显下降。本课题组在前期研究[6, 7]中已发现Naa10水平与口腔鳞状细胞癌患者的分化程度和淋巴结转移相关, Naa10水平与口腔鳞状细胞癌组织中的细胞分化呈正相关, 细胞分化越成熟, Naa10水平越高。本研究结果与前期在口腔鳞状细胞癌组织中的研究结果相符, 提示检测唾液中Naa10水平可能为准确判断肿瘤的病理分化程度提供强有力的参考。血清中Naa10水平却与分化程度无关, 分析可能原因如下:1)与血清相比, 唾液和癌组织更接近原发病灶, 使得唾液和癌组织可通过物质转运接触到更多的癌细胞代谢产物, 同时血液中的分子也可以经由跨细胞(例如被动和主动转运)或细胞旁(例如细胞外超滤)途径进入唾液腺组织, 潜在地影响唾液的分子组成; 2)可能与本课题组研究样本量不足有关。当然也有可能是因为不同患者群体的异质性、各实验室使用不同检测方法造成的误差。除此之外, 唾液和血清中Naa10水平与性别、组别、临床分期、淋巴结有无转移均无相关性, 然而本课题组[8]前期在口腔鳞状细胞癌组织中已发现淋巴结转移者Naa10水平低于无淋巴结转移者, 可以看出Naa10在肿瘤转移中的关系具有争议性, 推测是与同一肿瘤在不同组织类型中不同种类细胞导致Naa10水平出现了差异, 具体原因仍有待进一步深入研究。

随着分子生物学技术的发展, 其他体液(如唾液、尿液、积液等)也可作为肿瘤标志物检测的中介物。唾液作为存在于口腔内的体液, 其包括口腔黏膜脱落细胞及其分泌代谢产物。尤其是在口腔黏膜组织发生癌变时, 癌瘤组织代谢高, 代谢产物增多, 且由于癌细胞彼此间黏着力比正常细胞低, 更易于脱落, 使得唾液中的组分也发生了相应的变化, 因此唾液与口腔恶性肿瘤关系密切。目前发现的关于口腔恶性肿瘤的唾液生物标志物已多达100多种。研究[9]显示, 口腔鳞状细胞癌患者唾液中凋亡抑制剂、鳞状细胞癌相关抗原、癌胚抗原、白细胞介素1β , 白细胞介素8等生物标志物均有显著改变。也有研究[10]在口腔鳞状细胞癌患者唾液中检测到了抑癌基因p53的突变。本研究发现, 无论是口腔鳞状细胞癌组还是正常对照组, 唾液中Naa10水平都明显高于血清中。为了评价唾液和血清中检测Naa10的诊断性能, 根据上述结果绘制ROC曲线。分析结果显示, 唾液中Naa10的灵敏度特异度和准确度均高于血清中Naa10, 提示在口腔恶性肿瘤中, 唾液中的Naa10水平优于血清中的Naa10。与血清中Naa10相比, 唾液中Naa10可能更适合作为诊断口腔鳞状细胞癌的单项指标。唾液所具有的简单、安全、无创、可反复取样等优点也使检测有较强的可行性。

综上所述, 唾液和血清中Naa10的水平变化可以协助口腔鳞状细胞癌的诊断。检测唾液中的 Naa10水平比检测血清对口腔鳞状细胞癌的诊断更具有临床意义。并且在唾液中Naa10与肿瘤分化程度相关, 提示Naa10或许通过组织学分型介入口腔鳞状细胞癌的发生、发展过程。但其通过何种路径发挥作用, 仍然是需要解决的问题。应用唾液中Naa10检测可提高诊断口腔鳞状细胞癌的灵敏度和准确度, 有助于对高危人群的筛查, 这将是唾液检测在后续研究中的发展方向。

The authors have declared that no competing interests exist.

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